基因定位与克隆PPT.ppt

2004年定位与克隆角膜环状皮样瘤基因　　　　　　　　 　　　 　 角膜环状皮样瘤是一种先天性角膜良性肿瘤，呈常染色体显性遗传，以双侧眼球角膜缘处环形淡黄色肿块为特征，可延伸到结膜，患者可出现视力的改变如弱视、斜视和散光。 皮样瘤由外胚层包括角化的上皮、毛发、皮脂腺和中胚层包括纤维组织、脂肪组织、血管组成 角膜环状皮样瘤家系图 基因组扫描的流程 DNA抽提 利用STR引物多重 PCR Genotype 基因分型 Linkage 连锁分析 侯选基因，突变检测 定位基因 多重PCR 使用PE公司一套覆盖基因组22条常染色体、高杂合度的微卫星位点引物，一共382对。 采用Touchdown程序结合多重PCR反应方法，将5～12种不同引物混合,放入同一管中进行扩增，总反应体积5μl 以上结果说明这个单体型在该家系中与疾病共分离，而这些重组事件的发生则将角膜环状皮样瘤疾病基因定位于4q24-26的D4S1572和D4S1522之间15.2 cM范围内 侯选基因的筛选 首先进行UCSC数据库（April, 2003）查询D4S1572-D4S1522之间15.2cM的基因资料 ，结果显示在这个区间总计有65个known genes,52个Reference genes 进行候选基因筛选时，考虑到组织发生中皮样瘤为异位到角膜的正常组织，推测角膜环状皮样瘤致病基因可能与胚层的移行、细胞的发育和分化密切相关 侯选基因的筛选 通过筛选，选取其中3个能与组织细胞的发育分化和移行有关并在眼睛表达的基因： CXXC4 PITX2 TM4SF9 PITX2——是一个转录调控因子，与发育相关， 有重要的功能 神经性耳聋疾病基因GJB3的克隆 GJB3基因的计算机克隆 3’RACE 或者nested-PCR共获得cDNA 片段1059bp， 其中 ORF 813bp，编码的氨基酸 270aa个。该ORF与小 鼠Gjb3在813bp的一致性为83.4%，与大鼠Gjb3在813bp的 一致性为84.6%。推测的氨基酸与小鼠Gjb3在270aa 的一 致性为82.6%，与大鼠Gjb3在270aa的一致性为83%。 蛋白质的结构: 4个跨膜区 2个胞外区 3 个胞内区 原位杂交法（FISH） 如果一个基因或基因的某一部分已经被克隆，则可将该基因用同位素或荧光标记和染色体原位的分子杂交，在染色体上恒定出现信号的区域即该基因在染色体上的位置。同一染色体上的多个不同的基因可用不同的荧光标记来鉴别他们在染色体上的相对位置，运用这一方法在中期染色体上，可区分两个相隔约2Mb的基因；在间期染色体上，据称可鉴别仅相隔50kb的两个基因。 CONNEXIN31.1 候选克隆：根据基因的功能、结构及已有的研究发现，预测可能与目的新基因有关的疾病，然后在相应患者中检测该基因的突变情况。 位置克隆：目前最常用的方法，将某一疾病的致病基因用连锁分析的方法定位在某一染色体的特定位置上或区域内，然后在该位置上或区域内鉴定其致病基因。 连锁分析原理 生殖细胞在减数分裂时发生交换，一对同源染色体上存在着两两相邻的基因座位，若两者之间距离较远，发生交换的机会较多，则出现重组次数就多；若两者之间距离较近，则重组机会较少。 连锁分析就是根据基因在染色体上呈线性排列，不同基因相互连锁成连锁群的原理，即应用被定位的基因与同一染色体上另一基因或遗传标记相连锁的特点进行定位。 1 2 3 基因分型 Genotyping 除性染色体外，每个人体内的染色体都有两份。一个人所拥有的一对等位位点的类型被称作基因型genotype。 对SNP位点而言，一个人有三种可能性，分别是AA，AG或GG 。这种基因型的差异叫做单核苷酸多态性(SNP)。 通过实验确定某个个体在某个多态性位点的基因型，被称作基因分型。 几种多态标记: （1）RFLPs （2）STRPs （3）SNPs 第一代标记： RFLP（restriction fragment length polymorphism）。 限制性内切酶可在特定的核苷酸位置切割DNA。DNA序列的改变甚至是一个碱基的改变，都可能改变限制性内切酶酶切片段的长度，通过凝胶电泳可以方便地检测这种长度的“多态性”。RFLP在整个基因组中都存在，根据对RFLP片段的多态性分析，可对某些疾病进行诊断并将与疾病有关的基因进行定位。 ——/projects/genome