基因工程-2-工具酶PPT.ppt

第二章 基因工程的工具酶;第一节 限制性内切酶; 第一节 限制性内切酶 定义:能够识别和切割双链DNA(dsDNA)分子内特异核苷酸 顺序的核酸内切酶,叫做限制性核酸内切酶.;GAATTC;限制和修饰的作用;三、II型限制性内切酶切割类型;2.1 产生5’粘性末端 ;;1、同裂酶 指来源不同但识别相同序列且切割位点相同。; 3、同尾酶 这一类的限制酶来源各异，识别的靶序列也不相同，但产生相同的粘性末端。;4、酶的星号活性 当酶切条件改变时，酶的专一性可能会降低，以至于同一种酶可识别和切割多个的位点。;5、双酶切方法;1、命名三原则 取属名第一个大写字母,种名前两个小写字母 取变种、品系第一个字母构成限制酶的名称 在同种生物中发现几种酶,按先后顺序用罗马字母Ⅰ、Ⅱ…;DNA 1μl(1μg) buffer(10×) 2μl ddH2O 16μl 限制性内切酶 1μl(1u) 总体积 20μl;1.底物 DNA 1.1 DNA纯度: 1.1.1 RNA 与 E 结合影响有效酶浓度； 1.1.2 提取时混入杂质可改变识别特异性。 1.2 DNA浓度: [DNA]过大，抑制酶活，影响酶分子扩散 如：4μg DNA /1U HPaⅠ 50μl 37℃ 15h 1μg DNA /1U HPaⅠ 50μl 37℃ 1h ;2.识别位点及邻近位点特异性序列 XmaⅢ切点（CGGCCG）在GGCGGCCGCC时不切割。 3.DNA二级/三级结构 如：超螺旋DNA(病毒或质粒)比线状DNA需酶多; 4.反应系统因素 （1）缓冲液（无菌、无污染） （2）金属离子 （3）牛血清蛋白(BSA) （4) 温度与反应时间;1.DNA重组 2.构建载体 3.DNA顺序分析4.遗传病诊断;;;;;;;;;第二节 DNA连接酶 ;二、DNA连接酶的连接范围 ;三、DNA连接酶的连接条件 ;四、DNA连接酶的连接反应机制：;五、T4 DNA连接酶的反应条件;指在DNA模板指导下，以4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）为底物，在引物3’-OH末端聚合DNA链的一类酶。 一、种类 聚合酶Ⅰ（polⅠ），DNA损伤修复，在半保留复制中起辅助的作用 聚合酶Ⅱ（polⅡ），在修复损伤中有重要的作用 聚合酶Ⅲ（polⅢ），DNA复制过程中起主要作用 聚合酶Ⅰ是基因工程中的常用酶。;二、DNA聚合酶的特点： 1.需模板DNA； 2.需引物； 3.具有三种酶活性。;三、DNA聚合酶的活性;四、Klenow酶;2.Klenow酶的三维结构;3.Klenow酶使用注意事项;5‘ 3’;五、DNA聚合酶的应用 ;五、DNA聚合酶的应用 ;五、DNA聚合酶的应用 ;5.1 来源： 水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1 5.2 活性： 聚合最适温度为75-80℃， 不具3’→5’外切酶活性， 具5’→3’外切活性 。;第四节 反转录酶（reverse transcriptase） ;①依赖RNA的DNA聚合酶活性 ;三、用途;试剂名称 使 用 量 模板RNA 1 μg Oligo dT Primer（50 μM） 或Random Primers（50 μM） 或Specific Primer（2 μM） 1 μl dNTP Mixture (10 mM each) 1 μl RNase free dH2O up to 10 μl ; 试剂名称 使 用 量 上述模板RNA/引物等的混合液 10 μl 5×Buffer 4 μl RNase Inhibitor（40 U/μl） 0. 5 μl 反转录酶（200 U/μl） 100～200 units RNase free dH2O up to 20 μl ;一、单链核酸酶（S1/ Bal31 Nuclease) ;1.S1单链核酸酶的用途 ;2.Bal31单链核酸酶的用途 ;;二、末端转移酶;①ssDNA 3’-OH加尾 ;三、碱性磷酸酶与磷酸激酶;OH;基因工程的工具酶总结