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基因工程技术;第三章 基因工程的常用载体;主要内容; ;作为运载体必须具备哪些条件？;细胞内独立的能够自我增殖的结构单位为复制子； 包括与复制控制有关的结构和与复制控制无关的 结构； 细菌的染色体是一个复制子，而真核生物染色体是 多个复制子的复合体。 ;可自然形成超螺旋，大小在2-300kb。还有开环（ocDNA）和线状两种状态。 质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用（不同于线粒体）。 是基因工程最常用的运载体。 ;2、质粒的种类; 抗药性包括：氯霉素（Cm），氨苄（Ap） 氯霉素（Cm）；卡那（Km）；链霉素（Sm） 对金属离子抗性 砷（As3+），汞（Hg2+），镍（Ni2+）银（Ag+）;（1）自主复制性 是能独立复制的复制子。质粒DNA复制的质粒可随宿主的分裂传给下一代。 ; 根据复制的控制和每个细胞中的拷贝数多寡，质粒可分为两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid ）：复制与宿主的繁殖相耦联，受寄主复制起始蛋白控制， 1 - 3 拷贝 松弛型复制控制的质粒（relax plasmid ）： 复制不与宿主的繁殖相耦联，几十至几百拷贝 ;（3）不相容性 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。 ; 两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。 ; 革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： 接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如含F因子质粒等； 非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用； 目前在基因工程实验室中常用的质粒属于此类。; 质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，常见性状包括： 抗生素抗性（如 抗四环素、Amp、Kan） 重金属离子抗性基因、 复杂有机物的分解基因?。 它们通常是宿主细胞生长所非需的。 颜色反应（??蓝白筛选） ;4、质粒改造构建;（4） 分子量尽可能小 缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率， 增加装载量 （5） 改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝 （6） 应为非传递性质粒 ;5、质粒的分类;6、实验室常用质粒; 特点： 1）分子量小，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（不用氯霉素扩增，每个细胞含500-700个拷贝）。 2）抗性和蓝白筛选,易于 检测。 3）多克隆位点区（MCS）.; β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。 这两个部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为标记基因。 ;;β—半乳糖苷酶基因的优点: a.?酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5‘-端可容许很大的变化（如加入多克隆位点）而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大;pUC衍生载体; 由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种不同寄主细胞中进行存活和复制的质粒载体。 大肠杆菌-酵母，大肠杆菌-枯草芽孢杆菌; T7 promoter：T7 特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等。 ;7、 质粒DNA的分离纯化; 图1 图2;质粒大小应以线性 状态做判断; 分子量，拷贝数多 为内切酶提供切点的机会小 容易提取 ; 噬菌体是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来。;温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期的噬菌体．（双链ＤＮＡ） 烈性噬菌体：只有溶菌生长周期的噬菌体．　;λ 噬菌