基因工程6PPT.ppt

Preface;4. Validly transcription beginning;Section1 Factors Related to High Expression of Cloned Genes;Section1 Factors Related to High Expression of Cloned Genes;; ;1.1 复制子是一段包含复制子起始位点和反式因子靶序列在内的DNA片段。 大肠杆菌基因表达系统的表达载体一般是质粒表达载体，含有大肠杆菌内源质粒复制起始位点和有关序列组成的能在大肠杆菌中有效复制的复制子。;1.2启动子和终止子 启动子是调控外源基因转录的重要顺式元件。理想的启动子应该具备以下性质： 第一, 必须是强启动子，能够克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10%-30%以上 第二, 这个启动子应能呈现出一种低限的基础转录水平，因为在表达毒性蛋白质或是有损于寄主细胞生长的蛋白质的情况下，使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件 第三, 这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。;外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即 RNA 聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的 DNA 序列，形成长短不一的 mRNA 混合物过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子 mRNA 所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降； 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或 DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则 RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的 mRNA 往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构， 从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率。;强终止子的选择与使用 目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌 rRNA 操纵子上 的 rrnT1T2 以及 T7 噬菌体 DNA 上的 Tf。 对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特 殊结构，以增强其转录终止作用;1.3核糖体结合位点(Ribosome biding site, RBS) 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表??不仅取决于转录启动的频 率，而且在很大程度上还与 mRNA 的翻译起始效率密切相关。 大肠杆菌细胞中结构不同的 mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。 mRNA 翻译的起始效率主要由其 5’ 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）。 ; 大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素： 位于翻译起始密码子上游的 6–8 个核苷酸序列 5’ UAAGGAGG 3’ 即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚 基中的 16S rRNA 3’ 端区域 3’ AUUCCUCC 5’ 并与之专一性结合 将mRNA 定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以 AUG作为阅读框架的 起始位点，有些基因也使用 GUG 或 UUG 作为翻译起始密码子 SD 序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成 基因编码区 5’ 端若干密码子的碱基序列;1.4密码子 不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性。外源基因在大肠杆菌中的表达需考虑密码子的偏好性。 1.5选择标记 大肠杆菌的选择标记一般采用抗生素抗性基因。;2.宿主菌 外源基因表达产物在大肠杆菌细胞内容易被降解，为了避免降解，需要构建与表达载体相适应的大肠杆菌宿主菌。 ;3. 常见的大肠杆菌表达系统 目前应用广泛的大肠杆菌表达系统主要有Lac和Tac表达系统，λPL和λ PR表达系统，T7表达系统。 Lac和Tac表达系统是以lac操纵子调控机制为基础构建的表达系统。;P tac = 3 P trp = 11 P lac; 转录