基因工程 03 基因工程的载体PPT.ppt

Office: Room 409 of Experiment Building No. 3 : 06358230050 , : glzhou@ : 448953745;Office: Room 409 of Experiment Building No. 3 : 06358230050 , : glzhou@ : 448953745;;CONTENTS;重点与难点内容;　1）独立的一个包括启动子（promoter)、编码区（encoding region)和终止子（terminator)的基因，or 组成基因的某个元件，一般是不可以进入受体细胞的； 　2）采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体细胞内维持。所以，通过不同途径能将承载的外源DNA片段带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子称为基因工程载体。;;; ;;;1. 质粒载体;1.1质粒的一般生物学特性;1.1质粒的一般生物学特性;1.1质粒的一般生物学特性;质粒的各种表型;;Plasmids are replicons which are stably inherited in an extrachromosomal state. ;双链完整，则为cccDNA(共价闭合环状DNA) 双链中只有一条完整，则为开环DNA(OC DNA);;*;同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同： scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。;1.3 分类:结合型和非结合型两种 ;;Tra protein from conjugative plasmid;;如果tra和mob都缺失，不能接合，也不能转移。 如果缺失了一部分的mob，且缺失的部分仅与转移蛋白的拷贝有关，可通过另一组基因nic/bom来代偿。 顺式作用元件nic/bom不会与其它质粒发生交换，因此从生物安全的角度看，非接合质粒是安全的。这是它作为载体的第一个有利条件。 非接合质粒的高拷贝是人工构建载体的第二个有利条件！ ;1.3 分类:松弛型和严紧型两种 ;Generally, conjugative plasmids are of relatively high molecular weight and are present as one to three copies per chromosome, whereas non-conjugative plasmids are of low molecular weight and present as multiple copies per chromosome . An exception is the conjugative plasmid R6K, which has a molecular weight of 25 ×106 daltons and is maintained as a relaxed plasmid.;1.4 INCOMPATIBILITY OF PLASMIDS(质粒的不相容性);MOLECULAR MECHANISM（质粒不相容性的分子机制）;HOST RANGE OF PLASMIDS;PROTEINS ENCODED BY PLASMIDS;1.6 质粒载体的选择;1.6 质粒载体的选择;表达质粒载体;;表达载体与克隆载体的区别;表达型载体（expression vector）;表达型载体（expression vector）;THE ADVANTAGES OF A LOW MOLECULAR WEIGH（???分子量的优点）;多克隆位点（MCS）;;1.6.1 第一个用于基因克隆的天然质粒PSC101;天然质粒的缺陷？;人工改造的克隆载体PBR322及插入失活原理;;THE PEDIGREE OF PBR322 (PBR322的谱系);A summary of the origins of pBR322.;PBR322的筛选方式：INSERTIONAL INACTIVATION（插入失活）;*;1.6.2 PUC18/19(A LAC selection plasmid)（PUC18/19和蓝白斑筛选原理）;Structure of pUC18/19;pUC18/19与pBR322在结构上的主要差别在于：用乳糖操纵子的一个DNA片段（466bp）替换了pBR322选择标记Tcr 基因——于是筛选原理也不同（蓝白斑筛选）。 此DNA片段含有乳糖操纵子的启动子、调节因子和β－半乳糖苷酶的α-肽基因。;Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-?-D-galactos