第一章 基因工程PPT.ppt

（四）人工合成基因 引用DNA测序仪测出某一基因的碱基序列，或根据某一蛋白质的氨基酸组成反推核苷酸序列，再用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。 一般先合成短片段DNA，然后再拼接成长片段。 六、重组DNA导入宿主细胞（转） 重组DNA导入宿主细胞的类型 转化 以质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程； 转染 以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程； 转导 以噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程。 感受态细胞 用特殊方法处理后，受体细胞具有易于接受外源DNA的能力， 这种细胞称感受态细胞。 感受态细胞有原核细胞和真核细胞两大类。 七、重组DNA的筛选与鉴定（筛） （筛选含重组体的阳性菌落，一般有下列几种方法） 1） 平板筛选 2）原位杂交技术 3） PCR筛选重组体 4）限制酶切图谱筛选 5）序列测定 6）免疫法 插入失活 蓝－白筛选 1 平板筛选 是指利用载体的遗传性标记直接筛选的方法。 如，具有抗药性标记的载体， （1） 插入失活 当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使 该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的 培养平板上。 抗生素平板筛选（插入失活） （2）蓝-白筛选 利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选含有编码β-半乳糖苷酶的基因。 载体：编码β-半乳糖 宿主： 编码β-半乳糖 苷酶N端序列 苷酶C端序列 α-互补 细菌表达： β-半乳糖苷酶活性蛋白↑ 5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落 当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→不能与宿主β-半乳糖苷酶的C端进行α-互补→产生白色菌落。 （IPTG 存在下） 蓝－白筛选示意图 2. 核酸杂交筛选 3. PCR筛选重组体 抽提少量重组DNA→PCR扩增→电泳鉴定 4、 序列测定 通过核酸测序，来确定外源基因准确性 5、免疫法 免疫法测定只能是所转移外源DNA必须表达后才能进行，而且必须具备有效的特异性抗体。 显色或显影 Protein Protein Blocking Agent Blocking Agent Blocking Agent E E Primary Antibody Secondary Antibody－Enzyme (E) s s s s s P P P P Substrate 6. 限制性内切酶图谱鉴定 八、重组体在宿主细胞中的表达和调控 基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白质产品。 ㈡ Klenow片段（DNA pol I大片段） Klenow片段用途 ⑴ 补齐双链DNA的 3ˊ末端； ⑵ 用标记碱基补 齐3ˊ末端 ； ⑶ 在cDNA克隆中， 用于第二股链 的合成； ⑷ DNA序列分析。 ㈢ T4 噬菌体DNA 聚合酶 作用特点 1） 具有5ˊ→3ˊDNA 聚合酶活性 和3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性，类似DNA pol I大片段 2） 不从单链DNA模板上置换寡核苷酸链 3） 最适合用于体外突变反应 ㈣ Taq DNA pol（耐热DNA聚合酶） 作用特点 1） Taq DNA pol催化DNA合成的最适温度范围 70 ? 75℃， 2） 95℃以上高温，半小时不失活， 3） 最适合用于聚合酶链反应（PCR）。 4、逆转录酶 逆转录酶是一类依赖于RNA的DNA聚合酶 特点： 逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶活性： ⑴ 以单链RNA 为模板， 催化合成DNA单链 ⑵ 具有RNase H 活性，能水解RNA:DNA杂交链中的 RNA ⑶ 以DNA为模板，催化合成cDNA双链。 逆转录酶的应用： ⑴ 将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库； ⑵ 补平和标记5ˊ-末端突出的DNA片段； ⑶ 代替Klenow酶用于DNA序列分析； ⑷ 制备杂交探针等。 5、碱性磷酸酶 碱性磷酸酶(BAP) 能够催化水解去除DNA或RNA5