食品生物应用技术第二章 -02节-基因工程的载体PPT.ppt

第二章 基因工程及其在食品科学中的应用;1、质粒载体 (1) 质粒的生物学特性 质粒 (plasmid) ：是指细菌等生物细胞内一类独立于染色体外而能自我复制的遗传物质 ，一般为双链(double strand，ds)的共价闭合环状DNA(covalently closed circularDNA，cccDNA). ① 质粒依赖于宿主编码的酶和蛋白质进行复制和转录，是宿主的共生物 ;② 质粒的不亲和性(plasmid incompatibility)，也称不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存的现象 ③ 彼此不相容的质粒属于同一个不亲和群(incompatibility group)，而彼此能够共存的亲和质粒则属于不同的不亲和群 ;(2) 质粒的分类 有三种分类方法： 根据赋予宿主的遗传性状分类、根据转移能力分类和根据复制控制类型分类。 ① 根据赋予宿主的遗传性状，一般大肠杆菌质粒可分为F因子(性因子)、R质粒(抗药性因子)、Col质粒(产生大肠杆菌素因子)等 ② 根据转移能力，一般可将大肠杆菌质粒分为接合型质粒和非接合型质粒 ③ 根据复制控制类型，一般可将大肠杆菌质粒分为严紧型复制控制质粒（stringent plamid ）和松弛型复制控制质粒（relaxed plasmid ）;（3）质粒载体的条件及选择 质粒克隆载体是指能将外源基因携带至宿主细胞并可在其中自主复制的质粒DNA 理想的质粒克隆载体一般具备以下条件： ① 分子结构中具有多个单一限制酶切位点，具有易被检测的选择标记基因，且切点位于选择标记基因上；② 能插入、运载一定大小的外源基因；③ 在宿主细胞内能自主复制；④ 在与外源基因构建重组质粒后具有转化功能；⑤ 分子量小，易于操作，一般为松弛型复制控制；⑥ 容易控制，安全可靠。;;; 为了方便起见，统一规定该环状质粒载体DNA分子中核苷酸的计数从EcoR I的识别序列开始。在该识别序列GAATTC中，以第一个T为核苷酸1，然后沿着从tetr基因到ampr基因的方向顺序计数，如此画出该质粒的碱基序列结构图 ;② Bluescript Ml3+、Bluescript Ml3-：是一对带有M13噬菌体DNA复制起点ori的质粒载体。这对载体可在体内或在体外产生互补于插入到其多克隆位点的外源双链DNA中任一条链的单链DNA???RNA。 2、噬菌体载体 （1）噬菌体的生物学特性 噬菌体(bacteriophage)是一类细菌病毒的总称 ;③ 噬菌体的生命周期可分为溶菌周期和溶原周期 溶菌周期是指噬菌体吸附到宿主细胞表面后注入DNA，经过DNA复制及蛋白质合成，组装成子代噬菌体颗粒，最后使宿主细胞破裂，释放出子代噬菌体颗粒的生长周期 溶原周期是指噬菌体在感染过程中不产生子代噬菌体颗粒，而将噬菌体DNA整合到宿主细胞染色体DNA中；成为其组成部分的生长周期 只具有溶菌周期的噬菌体被称为烈性噬菌体。 具有溶原周期的噬菌体被称为温和噬菌体。 ;烈性噬菌体的生活周期;裂解循环; 具有一套噬菌体完整基因组的细菌被称为溶原性细菌(1ysogen)。以温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶原性细菌的过程被称为溶原化(1ysogenization)。整合的噬菌体DNA是指插入宿主细胞染色体DNA中的噬菌体DNA；而以质粒DNA分子形式存在的噬菌体DNA被称为非整合的噬菌体DNA。;噬菌体的侵染循环;（2）λ噬菌体载体 ;λ－DNA的结构; λDNA为线状双链DNA分子，两端各有一个12核苷酸的互补单链（粘性末端）GGGCGGCGACCT, CCCGCCGCTGGA，当入噬菌体感染宿主细胞时，λDNA被注入宿主细胞后会迅速通过黏性末端的互补作用形成环状双链DNA分子，这种由黏性末端结合形成的双链区段称作cos位点(cohesive-end site)。; λ噬菌体在宿主细胞中繁殖时，复制的DNA必须被包装到已组装好的头部，并再接上尾巴后才能成为成熟的噬菌体颗粒，才具备感染大肠杆菌细胞的能力。噬菌体要具有感染性，被包装的DNA必须具有一定的长度。野生型λ噬菌体DNA(48.kb)被包装的效率最高，并且所形成的噬菌体颗粒具有最强的感染性。如果被包装的DNA与入噬菌体载体的总长度短于野生型λDNA长度的78％或者长于野生型λDNA长度的105％，那么就不能形成具有感染性的噬菌体颗λ噬菌体载体中取代了非必要基因的外源基因可随宿主细胞一起复制和增殖。;λDNA噬菌体载体的优点: ①可携带较长的外源DNA片段。 ②重组