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（交流）别小瞧了ELISA 第一次作ELISA，真***的简单，偶暗想。第二次做，咿，结果差别这么大（同一份标本）怎么还有跳孔。第三次，决定做的认真一些，争取作到同一份标本，做两到三次，板间无差异，发觉很难。原来ELISA 也这么讲究。看看ELISA的注意事项吧：（一）加样　　在ELISA中除了包被外，一般需进行4－5次加样。在定性测定中有时不强调加样量的准确性，例如规定为加样一滴。此时应该使用相同口径的滴管，保持准确的加样姿势，使每滴液体的体积基本相同。在定量测定中则加样量应力求准确。标本和结合物的稀释液应按规定配制。加样时应将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出现气泡。　　（二）保温　　在ELISA中一般有二次抗原抗体反应，即加标本后和加结合物后，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱，可使温度迅速平衡。各ELISA板不应叠在一起。为避免蒸发，板上应加盖，或将板平放在底部垫有湿纱布的湿盒中。湿盒应该是金属的，传热容易。如用保温箱，空湿盒应预先放在其中，以平衡温度，这在室温较低时更为重要。加入底物后，反应的时间和温度通常不做严格要求。如室温高于20℃，ELISA板可避光放在实验台上，以便不时观察，待对照管显色适当时，即可终止酶反应。　　（三）洗涤　　洗涤在ELISA过程中不是反应聚，但却是决定实验成败的关键。洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯待塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的。因此在ELISA测定的反应过程中应尽量避免非特异性吸附，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。在标本和结合物的稀释液和洗涤液中加入聚山梨酯（吐温，Tween）一类物质即右达到此目的。聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，为非离子型的表面张力物质，常作为助溶剂。根据脂肪酸的种类而对聚山梨酯编号，结合月桂酸的为聚山梨酯20，在ELISA中最为常用。它的洗涤效果好，并具有减少非特异性吸附和增强抗原抗体结合的作用。　　洗涤如不彻底，特别在最后一次，如有酶结合物的非特异性吸附，将使空白值升高。另外，在间接法中如血清标本内的非特异性IgG吸附在固相上而未被洗净，也将与酶标抗体作用而产生干扰。　　ELISA板的洗涤一般可采用以下方法：①吸干孔内反应液；②将洗涤液注满板孔；③放置2min，略作摇动；④吸干孔内液，也可倾去液体后在吸水纸上拍干。洗涤的次数一般为3～4次，有时甚至需洗5～6次。 请叫大虾！在ELISA中除了包被外，一般需进行45加样。其中“45加样”是什么意思？ woshilaodaYYY wrote:请叫大虾！在ELISA中除了包被外，一般需进行45加样。其中“45加样”是什么意思？ 这里的45加样，应当为45度加样，即加样枪的吸头所在的直线应当与板条所在的直线呈45度角。ELISA中加样须注意如下问题：1. 吸取样品时，加样枪吸头不应黏附多余的液体；加样时不可90度向孔中滴加液体，这样会导致液体残留在吸头上，加样不准确！2. 不要将吸头伸入孔中，一方面若接触孔底可能压弯吸头，另一方面可能会将孔中的液体吹起来，加样不准确！正确的加样方法应为45度，吸头贴着孔壁加入，应注意：1. 角度太小，会使液体残留在孔壁上，导致加样不准确！2. 吸头应当贴着管壁和液面的交界处！  45度加样不知道根据何在？我看到Eppendorf建议是垂直不超过30度倾角才比较准确。 好像RD公司说明书讲要加孔底啊（指无液体时），当然不能触到板子。所以我采用上图第一种做法，不对吗?因为还要做，想知道准确的加样法 能给我讲一下ELISA吗?[外行]呵呵.THANK U. 各位园子里的新老战友，不好意思，最近比较忙，上的次数少了，没想到这篇小帖子引起这么多人关注，谢谢捧场！再者由于我的疏忽，造成大家误解，特表示歉意。1. to woshilaodaYYY ：“45”本意是4－5次加样，加包被液，一抗，二抗，底物等。而不是45度加样。2.coffejumps 所说应该有他的道理，不过ELISA 过程中主要是用移液器加样，只要保证把液体加到孔底，而且不沾于孔壁，至于采用多少度角，应该问题不大，自己把握了，呵呵。3.tocuilq2000 ：园子里有好多关于ELISA原理，步骤底帖子，你用“ELISA ”+原理或步骤search 一下，好好看一下，会有不少收获底。我下面列几个，你可以先看看：最后想说的是,尽信书不如无书，实验都是人作的，只要不违背基本的科学原则，你也可以有自己的创新嘛，本来实验实验就是要试着作一做。你也许就是未来的科学大家，实验“标准”的制定者，也说不定呢？！不知到我说的对不