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变性与复性Unfolding and Refolding 变性与复性 变性与复性 复性有关理论 复性有关理论 复性有关理论 复性有关理论 复性有关理论 蛋白质结构 蛋白质结构蛋白质的结构层次 促进与维系蛋白质折叠和天然构象的作用力 促进与维系蛋白质折叠和天然构象的作用力 促进与维系蛋白质折叠和天然构象的作用力 包涵体 包涵体对分离纯化的影响 包涵体的分离 包涵体的分离 包涵体的溶解 包涵体的溶解 蛋白质的复性 蛋白质的复性 蛋白质的复性 蛋白质的复性 稀释复性法 稀释复性法 稀释复性法 稀释复性法 稀释复性法 稀释复性法 稀释复性法 稀释复性法 稀释复性法 稀释复性法 稀释复性法 稀释复性法 稀释复性法 蛋白质复性时聚集反应的抑制 蛋白质复性时聚集反应的抑制 蛋白质复性时聚集反应的抑制 蛋白质复性时聚集反应的抑制 蛋白质复性时聚集反应的抑制 蛋白质复性时聚集反应的抑制 蛋白质复性时聚集反应的抑制 蛋白质复性时聚集反应的抑制 蛋白质复性时聚集反应的抑制 蛋白质复性时聚集反应的抑制 二硫键重排和组建 透析复性法 色谱复性法 凝胶过滤复性 凝胶过滤复性 凝胶过滤复性 凝胶过滤复性 凝胶过滤复性 凝胶过滤复性 凝胶过滤复性 凝胶过滤复性 凝胶过滤复性 尿素梯度凝胶过滤复性 尿素梯度凝胶过滤复性 尿素梯度凝胶过滤复性 尿素梯度凝胶过滤复性 尿素梯度凝胶过滤复性 尿素梯度凝胶过滤复性 尿素梯度凝胶过滤复性 凝胶过滤复性 亲合色谱复性 亲合色谱复性 亲合色谱复性 亲合色谱复性 亲合色谱复性 亲合色谱复性 疏水色谱复性 疏水色谱复性 离子交换色谱复性 离子交换色谱复性 各种色谱复性方法的比较 各种色谱复性方法的比较 展 望 谢谢! 尿素最终浓度对蛋白质回收率的影响 梯度长度对蛋白质复性活性回收率的影响 洗脱液流速对复性蛋白质活性回收率的影响 变性蛋白质浓度对稀释复性、凝胶过滤复性和尿素梯度凝胶过滤复性影响的比较 三种复性方法的活性回收率的比较 尿素浓度和pH联合梯度凝胶过滤色谱复性 是利用配体与目标蛋白质之间的特异亲合作用，使变性蛋白质分子保留在柱的顶端与变性剂分离，而后在洗脱过程中进行复性。 依使用的配体，用于复性的亲合色谱有：抗体亲合色谱、金属亲合色谱(IMAC)、脂质体亲合色谱和分子伴侣亲合色谱等。 因配体与目标蛋白质间的作用特异性强，且不同配体与不同蛋白质之间的作用差别大，亲合色谱作为蛋白质复性的机理比较复杂。 单链抗体融合蛋白scFv57P包涵体的复性。以与scFv57P有特异性结合的小肽C19V为配体的亲合色谱复性。 以金属离子为配体的亲合色谱复性法 如以Ni2+为亲合配体，可与末端标记有组氨酸的蛋白质分子有特异的亲合作用，而这种作用又不受强变性剂的影响，可用于重组蛋白质的复性。 脂质体亲合色谱复性 脂质体作为配体用于蛋白质复性的原理可能是：局部变形的蛋白质分子结构类似于融球状态，与具有天然蛋白质相似的二级结构，此时，蛋白质分子仍然具有强的疏水表面，可同脂质体的脂质双层作用，以帮助蛋白质进行复性。 比如碳酸酐脱氢酶的复性使用脂质体的柱子，活性收率为83%，不用为58%。 伴侣亲合色谱复性 分子伴侣是介导表达蛋白质建立天然构象的一类重要蛋白质，也是蛋白质体外折叠复性过程的辅助因子。在复性溶液中加入分子伴侣可提高蛋白质的复性效率，但溶液中引入了杂蛋白，给目的蛋白质分离纯化带来麻烦，且它价格昂贵，而无法应用。而将分子伴侣结合在适当的介质上构成分子伴侣亲合色谱介质，用于目的蛋白质的复性可克服上述缺点。 分子伴侣亲合色谱介导的蛋白质复性与它在溶液中的作用一样。为变性蛋白质提供一个中空环状的疏水腔，当变性蛋白质进入空腔后，可部分避免或完全消除变性蛋白质分子间的聚集作用，使蛋白质在疏水环境中进行“结合-释放-再结合”的循环过程，直到恢复其天然的构象状态。 利用合成的复杂的固定相体系成功地使一些用稀释法无法复性的蛋白质复性，因此，它又称为“折叠色谱”。 当变性蛋白质与变性剂、杂蛋白进入疏水色谱系统时，由于疏水固定相对变性剂的作用较弱，而对变性蛋白质的作用较强，变性剂首先与与变性蛋白质分离，并随流动相一同流出色谱柱；而疏水固定相提供较通常方法高出数十倍乃至数百倍的能量，在变性蛋白质被疏水固定相吸附的同时瞬时除去以水合状态附着在蛋白质表面和固定相表面接触域的水分子，而蛋白质特定的疏水氨基酸残基与疏水固定相表面作用形成区域立体结构，接着形成折叠中间体，随着流动相的不断变化，变性蛋白质