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第三讲基因克隆Gene Clone;基因 (DNA);基因克隆;一 基因;;Gene The functional and physical unit of heredity passed from parent to offspring. Genes are pieces of DNA, and most genes contain the information for making a specific protein. ;Three Major Activities of Gene;二 基因工程;基因工程的简化定义;三. 生物工程; 四. 基因工程的理论基础 1 40年代揭示了基因为DNA，是遗传物质的信息载体 2 50年代提出的DNA双螺旋结构模型与半保留复制，解决了基因的自我复制和传递问题 3 50年代末期提出的“中心法则”及操纵子学说，并破译遗传密码，阐明遗传信息的流向与表达的问题 （自我复制） DNA mRNA 蛋白质; (一)技术准备： 1 DNA的体外切割与连接技术 60年代末70年代初发展起来的重要基因操作技术，利用核酸内切酶与DNA连接酶可在体外将目标DNA切断，并按照设计将他们连接起来。 2 DNA的核苷酸序列分析技术 可以对目标基因进行序列分析。 3 基因克隆载体的发展 质粒、噬菌体、病毒等可以自主复制的复制子，可作为基因克隆的载体，完成基因设计的克隆。; 基因工程的基本原理：　主体战略思想是外源基因的高效表达，可从四方面达到目的：　1、 利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复制的特性与载体分子重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量，借此提高宏观表达水平。　2、 筛选、修饰重组基因表达的转录调控元件：启动子、增强子、上游调控序列、操作子、终止子。　3、修饰和构建蛋白质生物合成的翻译调控元件：序列、密码子。　4、工程菌（微型生物反应器）的稳定生产及增殖。;(二)植物基因工程的主要内容;外源基因;目的基因的概念;(三)植物基因的克隆;1 目的基因的分离和克隆 （1）鸟枪法 （构建基因组文库） 含目的基因的基因组DNA，用适当的限制性内切酶切割成片段，再用粘粒（cosimid）、λ噬菌体（λ phage）、细菌人工染色体（BAC）或酵母人工染色体（YAC）进行体外重组，形成重组DNA分子，转化到大肠杆菌，形成基因文库，然后用探针筛选基因组文库获得目的基因全长。 （2）mRNA分离法（构建cDNA文库） 在特定的组织器官中，特异??达的基因就会转录出特异的mRNA。提取mRNA用反转录酶反转录合成cDNA，构建cDNA文库。与不同植物组织提取的mRNA标记探针杂交作差示筛选技术即可获得组织特异性表达的基因。;（3）转座子标签法及T-DNA插入突变法 通过转座子插入目的基因，使原表型突变。目前常用的是玉米转座子Ac/Ds系统随机插入植株，大量筛选突变体，获取使植株表型发生变异的基因。基因组时代—后基因组时代主要应用于基因的功能的分析。水稻、拟南芥等应用较多。 （4）基因图谱的克隆法 随着植物DNA限制性片段长度多态性（RFLP）的高饱和度作图，植物每条染色体上都有相当数量的分子标记。可直接找出与标记紧密连锁的目的基因，或通过染色体步移（chromosome walking）查找到目的基因。 然而有些作物基因组很大，基因很复杂，实际操作中存在不少困难，有人试图首先在分子量较小的模式植物拟南芥中克隆抗病基因，然后利用同源性进一步鉴定分离其它相应的抗病基因，为植物抗病基因克隆走出一条捷径。;2 植物表达载体的构建;一、基因文库的构建;　　 把获得的基因插入到质粒中，可以转入细菌繁殖而复制（即克隆）。 用限制性内切酶将总DNA切成的许多小片段分别克隆到质粒或噬菌体载体上，便构成了该生物的基因文库。;Clone-by-clone shotgun sequencing;构建基因组文库的步骤;Date;Making a DNA library;b) Packing and cloning the recombinant DNA;二、cDNA的合成和克隆;双链cDNA与载体的连接： ①. 在3’-OH端用末端转移酶加poly(C)或poly(G) ②. 用Klenow酶将载体和cDNA分别补平，T4DNA酶连接. ③. 通过粘性末端连接. ;Date;Making a cDNA library;3.特定（低丰度）cDNA的克隆;Date;三、化学法合成目的基因;Date;Date;Date;3.寡核苷酸片段连接法： 第一种方法：用T4多核苷酸激酶，给寡核苷酸的5`端加上磷酸基团 相应互补片段退火，形