2第二章 常用实验方法mzw2016PPT.ppt

*;第二章 医学研究常用实验方法;（聚合酶链反应 ，PCR ， Polymerase Chain Reaction); 琼脂糖电泳示意图; PCR技术;DNA， 生命的蓝图;ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC;ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC;ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC;1953年，Watson和Crick提出DNA双螺旋结构及半保留复制模型。 1958年，Meselson和Stahl用实验证实DNA半保留复制模型。 70年代后，人们采用两种思路去尝试建立基因的无性繁殖体系，一是基因克隆技术，二是体外扩增技术。;;故事发生在1983年的春夏之交;Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA， ……;第一个PCR实验;1976年，台籍科学家钱嘉韵（Alice Chien）从黄石国家公园的嗜热菌Thermus aquaticus中分离出热稳定的Taq DNA聚合酶。 1985年，美国Cetus公司人类遗传研究室的Mullis发明聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），Saiki等首次应用PCR法成功地扩增了人?-珠蛋白的DNA，并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。;1988年Saiki开始将耐热性Taq DNA聚合酶应用于PCR，整个反应只加一次酶即可，扩增特异性和效率都明显改善，操作大为简化。 1989年被誉为“分子年”，列PCR为十余项发明之首。 1993年，Mullis荣获诺贝尔化学奖。;二、 PCR技术原理 ;模板DNA;;;;;;;*;（一）DNA模板的解链（变性） 94 ℃，30s 理论上，在90 ℃左右能使DNA双链之间的所有氢键链断开，完全分离为单链；且在中性pH情况下，DNA的完整性仍能很好保存。;（二）DNA 单链与引物的退火（复性） 55 ℃ , 30~45s 引物与模板单链特异性结合（较高的温度）； 不希望两条互补的模板单链结合在一起（DNA引物的量大大超过模板的量，竞争性结合：引物+模板几率DNA自身复性几率 ）;;（三）引物的延伸（新链DNA的合成） 72 ℃，30~60s （2kb) 首次循环：引物从3’端开始延伸，延伸片段的5’端为人工合成引物是特定的， 3’端没有固定的终止点，长短不一。 第二个循环：引物与新链结合，由于后者5’端序列是固定的末端，意味着5’端的序列就成为此次延伸片段3’端的终止点。 N个循环后：由于多数扩增产物受到所加引物5’端的限定，产物的序列是介于两种引物5’端之间的区域。 引物本身也是新生DNA链的一部分。;Synthesis by DNA polymerase -A T G C A T G C A T G C * * ;Synthesis by DNA polymerase -A T G C A T G C A T G C * * ;Synthesis by DNA polymerase -A T G C A T G C A T G C * * ;Synthesis by DNA polymerase -A T G C A T G C A T G C * * ;Synthesis by DNA polymerase -A T G C A T G C A T G C * * ;Synthesis by DNA polymerase -A T G C A T G C A T G C * * ;Synthesis by DNA polymerase -A T G C A T G C A T G C * * ;高度的特异性：引物的限定，高温扩增。 高度的敏感性：微量样品（单拷贝基因、单个细胞、一根头发等），高效性（X106）。 操作简便快速，易于自动化、程序化，方法稳定。 对标本的纯度要求底：纯化或粗制的，新鲜或陈旧的，各种细胞，体液，完整的或降解的DNA。;特异性强;特异性强;灵敏度高 　　PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg)量级的起始待测模板扩增到微克(μg)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。;30次循环后靶序列扩增的数量;简便、快速 　　PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析