6原生质体培养与诱变2012PPT.ppt

第六章;1 原生质体培养;原生质体培养：将细胞去除细胞壁后形成裸露的原生质体，把原生质体放在无菌的人工条件下使其生长发育的技术。 特点： ①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA； ②便于进行细胞融合，形成杂交细胞； ③与完整细胞一样具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株：;1.1 原生质体分离纯化 1.1.1 酶解法 一般用植物的体细胞（二倍体细胞）， 采用果胶酶、纤维素酶等酶类对植物细胞壁进行酶解，得到原生质体。 特点： ◆操作简单 ◆分离效果好 ◆细胞基本可保持完整性 ;分离原生质体主要是酶解法  首先要让酶制剂大量地吸附到细胞壁的纤维素上去，因此，一般先将材料分离成单细胞，然后分解细胞壁。采用将酶液减压渗入组织，或将组织切成薄片等方法，都可增加酶液与纤维素分子接触的机会。 酶处理目前常用的多是“一步法”，即把一定量的纤维素酶，果胶酶和半纤维素酶组成混合酶溶液，材料在其中处理一次即可得到分离的原生质体。植物材料须按比例和酶液混合才能有效地游离原生质体，一般去表皮的叶片需酶量较少，而悬浮细胞则用酶量较大。每克材料用酶液10～30ml不等。 由于不同材料的生理特点不同，在研究游离条件时，必须试验不同渗透压浓度的细胞，找出适宜的渗透浓度。例如，游离小麦悬浮细胞的原生质体的酶液中须加入0.55mol／L甘露醇，游离水稻悬浮细胞的原生质体的酶液中只加0.4～0.45mol／L的甘露醇，两者差别较大。 酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，将去表皮的一面朝下放入酶液中。去表皮的方法是：在无菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻轻撕下表皮。如果去表皮很困难，也可直接将材料切成小细条，放入酶液中。对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不均一，在酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将原细胞团去掉，留下较均匀的小细胞团时再进行酶解。;附：原生质体制备的操作步骤? ;2. 在酶液消化过程中，由于实验材料的个体差异，酶解时间不固定。因此要用显微镜随时检查酶解情况。 ;显微镜检查清洗后的原生质体，如碎片???多，则用蔗糖漂浮法去除碎片。 蔗糖漂浮方法：　　细口吸管吸20%蔗糖溶液，小心插入盛有原生质体悬液的离心管底部，缓缓将蔗糖溶液挤出。由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面。　　　离心5分钟（500转/分），此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处。　　用细管轻轻插入底部将沉将在离心管底部的碎片小心吹打，混匀在蔗糖溶液中，连同蔗糖溶液一起小心吸出， 　　再吸去上清液即得到健康的原生质体。 ;1）离心沉淀法 经酶解处理后得到一个由原生质体、细胞团和细胞碎片组成的混合液，需要进一步纯化。常用的纯化方法有： 离心沉淀法? 是?利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先行过滤再低速离心，使原生质体沉淀于试管底部。该方法比较简单，由于原生质体沉淀在一起相互挤压，常引起原生质体破碎。;2）漂浮法?? 应用渗透剂含量较高的高渗溶液使原生质体漂浮于液面。该方法能够获得比较纯净的原生质体；由于存在高渗溶液对原生质体的破坏作用，仅能获得少量的完好原生质体。 首先依照离心沉淀收集原生质体，之后将沉淀用洗涤液（3%蔗糖、0.4mol/L甘露醇、1480mg/L CaCl2.2H2O）或用11%~23%蔗糖液洗涤离心（400~800r/min,3~10min）2~3次，收集漂浮在溶液表面的原生质体，最后用培养液洗涤一次。;3）界面法?? 采用两种比重不同的溶液，其中一种溶液的密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度，原生质体即处于两种溶液界面之间。该方法可防止因挤压引起原生质体破碎，原生质体收获量较大。 首先依沉淀法收集原生质体，再用培养液离心沉淀一次，将沉淀置于2~3ml培养液中悬浮。取10ml离心管加入8ml 18%的蔗糖溶液，再取2ml原生质体悬浮液铺于其上，以700r/min离心2min，此时大量原生质体集中于培养液与蔗糖溶液之间，轻轻吸取原生质体，再用培养液离心洗涤一次，即可获得纯净的原生质体。;1.2 原生质体的活力测定 分离纯化后的原生质体需要检查活力并调整好起始密度后才能进行培养。对于新分离出来的原生质体的活力有以下几种测定方法。 1.2.1 形态识别 形态上完整，富含细胞质，颜色新鲜的原生质体有活力。若将形态上正常的原生质体放入低渗洗液或培养基中，可见到分离时缩小的原生质体又恢复原态。一般正常膨大的原生质体都是有活力的原生质体。 1