DNA测序原理PPT.pptVIP

第六章 DNA序列分析 人类基因组计划(human genome project, HGP) 人类基因组计划(human genome project, HGP)是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。总体计划在15年内投入至少30亿美元进行人类全基因组的分析。 美国、英国、法兰西共和国、德意志联邦共和国、日本和我国科学家共同参与。 我国承担其中1%的任务，即人类3号染色体短臂上约30亿个碱基的测序任务。 人类基因组 线粒体基因组 核基因组(约30亿个碱基) 基因外序列 基因和基因有关序列 约10% 约90% 专一或中等重复序列 Non-coding DNA 假基因 内含子 基因片段 10% 90% 专一的或低 拷贝数序列 中度至高度重复序列 20~30% 70~80% 分散重复序列 串联重复序列/ 成簇重复序列 约60% 约40% 蛋白编码 基因 rRNA 基因 tRNA 基因 Coding DNA 序列测定的技术 杂交测序法 质谱法 单分子测序法 原子探针显微镜测序法 DNA 芯片法 经典方法: Sanger双脱氧链终止法(Sanger,1977) Maxam-Gilbert DNA化学降解法(Maxam Gilbert,1977) 新技术方法: Dideoxynucleotides（双脱氧核苷酸） ddNTPs 是反应终止剂 可以当作正常碱基参与复制，一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接。 反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs(一般3~4 ：1)。 * 少一个－OH 脱氧核甘酸 与 双脱氧核甘酸 结构比较 H Sanger第一步：加入复制终止剂 荧光检测探头 电泳，看谁跑得快 ddNTPs参与下的DNA复制 Sanger法测序产物的平均链长取决于ddNTP与dNTP的比例，比例高时，得到较短的产物； Gel Electrophoresis DNA Fragment Size Determination DNA 带负电 DNA在电泳胶中的迁移率与其片段大小有关 Sanger第二步：荧光检测 除核苷酸序列文本文件外，全自动测序仪还提供曲线图。 Maxam-Gilbert化学裂解法 一个末端标记的DNA片段在几组互相独立的的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基。因此生成一系列放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。 碱基特异性化学切割反应： 硫酸二甲酯（DMS ）：使DNA分子中鸟嘌呤（G）上的N7原子甲基化。 肼：使DNA分子中胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶环断裂；但高盐条件下，只C断裂，而不与T反应。 哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。 在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基。 G反应：DMS使G在中性和高温条件下脱落。 G+A反应：酸性条件（如甲酸）可使A和G嘌呤环上的N原子质子化，利用哌啶使A、G脱落。 T+C反应：肼（低盐） C反应：肼（高盐） 测定DNA长度~250bp。 化学裂解法测定DNA的核苷酸序列 DNA片断序列测定的策略 测定未知序列的DNA片断 一次测序结果有长度限制（﹤1000bp) 通用引物指导未知序列的测定 引物步移 随机克隆测序 缺失克隆测序 通用引物指导未知序列的测定 根据载体序列设计通用引物测定待测DNA片断 引物步移策略 将待测DNA片断克隆在质粒载体上，利用引物步移延伸，从DNA片断的一端开始逐步进行序列测定，直至另一端为止。 克服了鸟枪法的盲目性，并省去亚克隆制备步骤，也减轻了数据分析工作量。 但由于测定下一段序列前要预先知道上游序列的碱基顺序，才能合成适当的引物进行测序。 定向缺失克隆策略、染色体步查法等。 鸟枪测序法(shotgun sequencing)：随机克隆测序 将待测的DNA片段随机打断并构建随机重叠克隆文库，然后通过通用引物测定每个克隆中的待测DNA序列。当这些已测序列的数量达到一定程度后，相当于待测DNA片断的每一部位的序列也就被测定出来了，通过这些所测序列之间的重叠部分，最终可将整个DNA片断的序列拼接出来，这样的测序策略称为随机克隆测序。    将DNA大片段切割成小片段的三种方法： 限制性内切酶酶切 超声波处理 DNA酶I降解(加Mn2+) * *