Sanger法测序PPT.ppt

Sanger法测序 --在HLA-SBT分型中应用;目录; HLA的介绍;为什么要进行HLA检测;HLA分型;PCR-SBT法分型的基本流程;;脱氧核糖核苷酸通过形成3?,5?-磷酸二酯键延长DNA链;测序原理;测序原理;PCR与测序反应的比较;测序反应操作步骤;预约PCR仪 编写测序反应表 根据要检测的样品数计算试剂的需要量 查看实验所需的耗材是否够用 用70％乙醇擦桌面，不能残留粉尘 ;Mix配制;Step2：振荡3秒或颠倒5次混匀，离心10秒，冰上或4℃避光保存，当天使用；剩余mix可-20℃保存，避免反复冻融，解冻2次内用完。;Mix配制注意事项;引物稀释;引物稀释;;反应加样;加样时注意事项：;加样时注意事项：;上PCR仪：;上PCR仪注意事项：;;测序峰图的简单分析;整板峰图的大概情况：;原始数据Raw窗口：;原因：1、模板质量差；2、模板浓度过高或者过低；3、纯化时样 品丢失；4、引物降解或者加错； 5、Bigdye浓度过低或者失效；6、 水污染；7、PCR仪温度不稳定;测序引物问题：;引物或模板不纯：;原因：1、模板不纯；2、模板上有两个引物结合位点；3、 加入两个引物；4、退火温度 过低；5、纯化时污染;原因：1、太多的模板量；2、Bigdye稀释过度；3、模板量 过少；4、引物过量；5、模 板纯化不好；6、模板上有不 容易测通的区域（如poly G）;原因： 1、部分测序反应失败；2、模板量太多或太少；3、 测序反应后纯化丢失了部分样品；;POLY结构对信号的影响：;Poly-G/poly-C很容易导致信号中断和信号乱：;Thank you!