动物细胞融合最终版ppt.ppt

医学细胞生物学设计型实验 实验项目:动物细胞融合  目录 1、实验目的 2、实验原理 3、实验步聚 4、实验预期结果 5、融合过程观察以及融合率的计算 6、实验试剂及材料 7、注意事项 一、实验目的 1、了解动物细胞的融合 2、熟悉PEG诱导细胞融合的方法 3、掌握动物细胞融合的基本原理及方法 4、培养学生自主设计实验发现问题和解决问题的能力 5、提高学生的实验技能及创新能力 6、督促学生学习实验方法，端正实验态度，培养良好的实验习惯。 自发细胞融合（ spontaneous cell fusion)： 指在未施加任何条件的情况下所发生的细胞融合现象。 人工合成形成的融合细胞有两类： 细胞融合的应用 三、实验步骤 （一）、50%PEG液的制备 根据实验需要，称取一定量的PEG（MV=4000）放入刻度离心管内，在酒精灯焰上加热，使其溶化，冷却至50℃时，加入等体积病预热的无血清1640液混匀，置之37℃水浴箱中保温待用。 （二）、融合方法： 1、取肝素抗凝的弃血清鸡血0.1ml(本实验是进行同种细胞融合）。 2、将悬液移入离心管中，以800r/min离心7～8min，倾去上清液，加入8～10ml Hanks液，再次悬浮细胞，离心洗涤一次，倾去上清液后将离心管倒置与滤纸上，尽量流尽剩余液体（这一步骤很重要，因为残留液体会改变PEG的浓度）。 3、用手指轻弹离心管底壁，使沉淀物松散，然后吸取制备好的50%PEG0.4ml，在37℃水浴中，于90s内逐滴加入离心管中，边加边振摇离心管，使之与细胞混匀，然后加入8～10ml Hanks 液，轻轻吸打混匀，在37℃水浴中静置5min 以稀释PEG。离心弃去上清液后，加入2～3ml含小牛血清的1640培养液，在37℃水浴中孵育30min。 实验操作流程 （一）50%PEG液的制备 （二）融合方法： 四、预期结果： （一）融合过程观察： 分别于温育5min、10min、15min、20min、30min取细胞悬液一滴制成临时装片，以0.2%次甲基蓝染液染色，在显微镜下观察细胞融合的不同阶段，通常可把融合过程大致分为5个阶段： 细胞融合过程图 五个阶段 两个细胞的膜相互接触，粘连。 相接的两细胞膜破口粘合形成细胞膜通道。 两细胞之间细胞质相遇，形成细胞质通道。 通道扩大，两细胞连成一体。 细胞合并完成，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。 （注：上述阶段可在不同时期观察） 五、融合率的计算： 融合率是指在显微镜视野内，已发生融合的细胞，其细胞核的总数与视野内所有细胞（包括已融合和未融合细胞）的细胞核总数之比。对孵育30min时制备的临时装片计算融合率。通常以百分数表示，进行多个视野测定值的平均统计更加准确。 融合率=（融合的细胞核数 /总细胞核数）×100% 六、实验试剂及材料 1、材料：HeLa细胞、CHO细胞、鸡红细胞。 2、试剂：聚乙二醇（PEG，MV=4000）Hanks液、0.25%胰蛋白酶、RPNI1640培养液（含10%灭活小牛血清和不含血清的两种）、PBS、0.2%次甲基蓝染液。 3、仪器设备：显微镜、水浴箱、普通离心机、高心管、载玻片、盖玻片、酒精灯、试管。 实验试剂表 实验仪器、设备、器具表 七、注意事项： 1、制备的50%PEG一定要保存于37℃水浴中，不然冷却后结晶析出。 2、在理想管中加PEG之前，一定要将离心管倒置于滤纸上，流尽剩余液体，否则残留液会改变PEG的浓度。 3.操作规范，防止试剂污染。 4.细胞悬液的涂片制作要轻柔。 5.使用离心机要注意平衡，转速从低到高。 Thank you ! * * * * * * * * * 2010级临床 姜俊 （一）动物细胞融合 1.概念： 细胞融合（cell fusion）：由两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程称为细胞融合。分为细胞自发融合和诱导细胞融合。 诱导细胞融合（ induced cell fusion） ：指在人为诱导条件下所发生的细胞融合现象。 二、实验原理 体内细胞的自发融合: 可以在受精过程、个体内的肌管形成、胚胎着床、巨细胞和破骨细胞的形成、肿瘤细胞的融合等过程中观察到。 由不同亲本 细胞融合而来 由同一亲本 细胞融合而来 异核体 同核体 2、动物细胞融合基本原理： 与植物原生质体融合的基本原理相同，即细胞膜的流动性 3、诱导方式 物理法： 化学法： 生物法： 灭活的病毒 电激、振动、离心 聚乙二醇（PEG） 例如：仙台病毒 灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面 细胞膜被病毒颗粒