免疫亲和色谱PPT.pptVIP

发; 免疫亲和色谱(immunoaffinity chromatography, IAC)是极为有效的样品制备方法。IAC根据分析物和其所引起的抗体之间有选择的和可逆的相互作用，从复杂样品基质中分离出分析物。通常，将载体上固定化的抗体移到小柱中，样品液通过重力或泵流过小柱。使用泵是更好的方法，因为它保证恒定的流速并可同时进行多柱操作。免疫化学相互作用的结果使分析物分子为固定化抗体所保留，但基质组分不与抗体作用而流出柱子。用磷酸缓冲液洗涤柱子将其余未保留的成分全部除去。洗涤之后，用比吸附缓冲剂离子强度大的和pH值低的缓冲液将被吸附的分析物脱附；分析物的分配平衡从配体移至缓冲液，因此将分析物洗脱。 ; 制备IAC基体首先需要抗血清，单独地看免疫原的合成和抗体的免疫与纯化方法和IAC本身不太有什么关联，但这些是所有免疫化学方法的主要部分。制成IAC基体，必须将抗体结合到载体上，且不能丢失太多活性。大多数情况下，抗体与载体以共价键结合，如聚丙烯酰胺(polyacrylamide)、三丙烯酰胺(trisacryl)、琼脂糖（agarose）、葡聚糖(dextran)和纤维素(cellulose)。 偶联之前，载体必须用试剂致活，如澳化氰( cyanogen bromide)、高碘酸盐(periodate)、三嗪(triazine)、羰基二咪唑( carbonyldiimidazole)或N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide)。 ; 在偶联操作时，免疫球蛋白与载体形成共价键的过程通常通过其氨基间的相互作用完成。 免疫亲和吸着剂显示的分析物容量通常比理论上计算的低，主要由于在固化中抗体部分失活，免疫球蛋白分子在载体上的随意固定化屏蔽了分析物的结合点。 分析物能键合免疫亲和柱上的最大量取决于在吸着剂上抗体分子的数目和取向。然而，一个免疫亲和柱的结合效率随流速、分析物浓度和样品溶液性质而变化。分析物实际上的保留量通常小于理论计算值。仅当低流速结合低浓度分析物通过柱子时，才可近乎理论计算值。; 为了从IAC基体中洗脱分析物，柱中需要有特定条件。洗脱步骤取决于抗体-分析物键的性质，一般是弱的物理性质的键。 由于免疫化学相互作用的物理键的类型在不同抗体-分析物体系之间变化极大，因而每个抗体的净化步骤有其自身的适宜??脱条件。 ; 免疫亲和柱能重复使用的程度主要取决于所分析的样品的性质和抗体与载体的稳定性。最重要的一步是除去物理吸着在抗体上的物质，以便使柱子能重现性地重复使用。在动物性食品样品正常脱脂和不含固体颗粒时，大多数柱子至少可使用100次。有报道，分析玉米、花生中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2时，用水洗柱使之再生，可重复使用50次以上；而用于啤酒中黄曲霉毒素B1、B2、 G1、G2测定时，用磷酸缓冲液洗柱再生，只能用1-2次。 ; IAC的选择性取决于固定化的抗体的特异性，因此，最好使用单克隆抗体。这样大量的样品可用免疫亲和净化而没有任何基质成分保留，从而使在动物性食品中很低浓度的药物残留测定成为可能。例如，当1L脱脂奶用免疫亲和净化后，能测定1L奶中的20ng氯霉素，回收率达99％。 能识别一类药物中所有组分的基本分子结构的多克隆抗体也可用于需要分析同类中的一些组分的分析。 ; 多免疫亲和净化（multi-immunoaffinity cleanup, MIAC）是将不同的多克隆抗体合装在一个柱中。 用GC-MS测定牛肉中的去甲睾酮和甲基睾酮，是将两个不同的多克隆抗体混合偶联到一个载体上。为了分析7个同化激素，用7个单独的IAC基体合在一个柱中。 ; IAC具有特异性高、耗时少、操作简便、节省溶剂等优点，然而要成为真正普及的技术，对IAC还有更多要求。 IAC基体的可供性是主要因素。除极少数外，大多数试验室没有生产抗体的设备。另外，订制抗体不一定能保证最后产品的质量，而且一般要等6-24个月才能得到血清。迄今，市场上能得到的免疫亲和柱和吸着剂仅限于激素、?-激动剂、皮质激素以及几种真菌毒素。当为了分析目的的抗体生产商业化成为现实时，IAC将会显示出它的潜力。