免疫印迹20100712PPT.ppt

电泳过程中易出现的问题: 缓冲液过稀,跑胶很快,带形很差 SDS浓度过高,结果也不好,因为SDS易引起样品聚集 看不到目的蛋白,可能由于已经跑出胶外: 使用预染MARKER 凝胶电泳—SDS胶厚度的使用低限为0.4mm.较厚的凝胶上加入较多的样品可提高灵敏度,但厚度必须2mm.最大灵敏度获得:胶厚达1.5mm,加大蛋白的上样量. 长胶可提高蛋白质的分辨率.必要时可让某些标志物跑出胶,以利于高分子量蛋白的分离. 电泳过程中易出现的问题: 电泳液过少：内槽超过短板，外槽约4CM深 蛋白条带弥散:样品可能在电泳前就已经弥散了,应加样后尽快电泳 笑纹效应(smile effect):指示剂前沿呈现两边向上的曲线形凝胶的不均匀冷却,中间部分冷却不好. “皱眉”现象(frown effect):指示剂前沿呈现两边向下的曲线形: 拖尾现象:样品溶解不佳. 蛋白条带融合在一起：液体过期或丙烯酰胺质量差 指示剂皱眉(frown effect) 原因:一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。 处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。 SDS失败实例及分析 蛋白样本皱眉 原因:一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净或制胶过程中中间部分受热不均 处理：在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡或重新制胶 指示剂微笑(smile effect) 原因：主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚凝胶。处理办法：待其充分凝固再作后续实验。 蛋白样品微笑 原因：电泳过程中受热不均或有气泡 处理：将电泳缓冲液先冷却后再用。 拖尾　(tailling) 原因：主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。处理：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。 纹理（streak） 原因：样品中存在不溶颗粒 处理方法：增加溶解度或离心除去不溶颗粒 上样过多 电流过大 多次加胶 电泳过早停止 条带歪斜 原因：电极或凝胶放置不正确 处理方法：重新校正电极及凝胶放置 电泳液被杂蛋白污染了。 配胶的DDW或者缓冲 或者其他试剂被蛋白污染 上样太大造成串带 第二部分：电转移 戴上手套，在转移缓冲液中操作 量好凝胶样品的大小，将NC膜裁至与胶同样大小，用转移缓冲液浸泡2分钟。 1.转移芯制备 具体步骤： 在转移盒上依次放入以下物品： NC膜 浸入式电转印 滤纸 支持垫 NC 凝胶 阳性电极 转印缓冲液 ⊕ 〇 尺寸：支持垫＞滤纸＞NC＞凝胶 将转移盒放入转移槽中，凝胶面朝向阴极，接通电源， 冰浴条件下， 100V(200mA)转移2小时。 取出转印膜，准备杂交。 2.电转移 具体步骤： 蛋白质从凝胶转印至膜： 半干转印法: 凝胶-膜夹层组合放在浸有转移缓冲液的吸水纸之间．优点：时间少，所需转移液少． 湿转印法: 凝胶-膜夹层组合完全浸入转移缓冲液中点：转移温和，不会过热，但费时，需较多的电泳液． 蛋白质从凝胶转印至膜： 湿转印法: 凝胶-膜夹层组合完全浸入转移缓冲液中点：转移温和，不会过热，但费时，需较多的电泳液． 半干转印法: 凝胶-膜夹层组合放在浸有转移缓冲液的吸水纸之间．优点：时间少，所需转移液少． 浸入式(湿式)电转印 滤纸 支持垫 NC 凝胶 阳性电极 转印缓冲液 ⊕ 〇 尺寸：支持垫＞滤纸＞NC膜＞凝胶 ★膜载体: 硝酸纤维素膜:在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起。通常用0.45μm和0.2μm两种规格，大于20kD的蛋白用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜 　　　缺点：结合力弱，易脱落 尼龙:只能结合少量蛋白,优点:机械强度好,不易变形 带正电荷的尼龙(PVDF):通过它膜上的正电荷和蛋白接合（注：常用的PVDF即带正电荷的尼龙膜），同时也有疏水作用可结合各种蛋白 　　　缺点:因膜表面有大量结合位点,背景差→改变封闭条件 　　　适用：低分子量蛋白 重氮化滤纸:能与蛋白共价结合,良好的机械强度.缺点:与许多凝胶电泳系统不相容;价格昂贵;活化后半衰期短 ★　转移液 转移液的导电性要尽可能低 甲醇可以提高转移速率 甲醇影响糖蛋白和高分子量蛋白的转移 常见问题 带上手套，尽量避免污染滤纸和膜 尽量使所有物品保持湿润 夹凝胶时注意，千万不要太用力，凝胶较脆，易碎 裁减好的滤纸和膜浸泡与电泳转移缓冲液中，可以注射器内筒驱除留于膜上的气泡。 印迹膜上总蛋白的染色 用以确定蛋白已经转印到膜上,以及了解转印至膜上的总蛋白质的组成情况. 用于凝胶染色的常规方法不适用于免疫印迹染色(背景高) 常用的染料有：氨基黑、印