免疫分析3PPT.pptx

免疫分析主要内容概述抗原或抗体的检测方法抗体的制备抗体纯化技术抗体的应用实例分析一、概述§1、抗体的概念与分类 定义一：抗原诱导由淋巴细胞合成和分泌的，具有特殊氨基酸序列和结构的免疫球蛋白分子(lg)。 定义二：能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白基本类型人源的免疫球蛋白的物理化学属性IgY免疫球蛋白鸟类产生的免疫球蛋白IgY在实际应用中有很多优点。鸟类能够产生一种能对高度保守而且免疫性较弱的哺乳动物的抗原有免疫作用的增强型抗体。因为鸟类和哺乳动物的系统进化差异性较远，所以IgY可以被用作一类专门抗哺乳动物抗原且只产生较少背景反应的专一性抗体。IgY免疫球蛋白型抗体通常是从蛋中生产的，这是因为蛋比血液样品更加容易收集。每周收集到的少数蛋产生的免疫球蛋白的量就能够同从一只免疫过的兔子上不停的吸血得到的抗体数量相当。§2、抗体的主要作用结合抗原中和毒素促进吞噬功能结合抗原和中和毒素? 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter.促进吞噬功能§3、抗原与抗体反应的特点一、特异性 抗原与抗体相互结合只局限于一些大分子表面的特定部位，即抗原决定簇和抗体结合位点之间，且以亲和力的作用方式结合在一起。抗原抗体的结合并没有共价键形成，而是由这些特定部位之间的短程分子力相互作用的结果。这些吸引力只有在极短的距离内才有效。因此抗原决定簇与抗体结合位点在空间上必须处于紧密接触状态，才能产生足够的结合力。这种分子间的互补结构决定了抗原抗体结合的专一性。二、抗原与抗体结合的可逆性 抗原抗体的结合反应是一个可逆的反应Ab+Ag Ab:Ag 由于抗原抗体结合的可逆性，可利用亲和层析法分离纯化抗原或抗体；利用待测抗原和标准抗原与抗体的竞争结合，进行抗原或抗体的定量测定，如放免检测法、酶联免疫吸附法等三、抗原与抗体反应中量的关系 当抗体与抗原结合时，如果是颗粒抗原，则出现凝集现象；如果是可溶性抗原，则产生沉淀作用。这些可见现象的出现是以抗原与抗体反应特异性和亲和力为基础的，同时也是抗原抗体反应的继发过程。 当抗原与同型抗体相遇时，在合适条件下，不论彼此量的多少，都立即发生特异性的结合形成抗原抗体复合物，这一过程通常只需要几秒的时间便可完成，称为反应的一级阶段。 在一级阶段之后，继发出现抗原与抗体间进一步交联而形成网络状凝集物，进而出现可见的凝集和沉淀，称为反应的二级阶段。这一阶段是抗原抗体网格生长的阶段，速率要慢的多，且在很大程度上依赖于温度、离子强度等外界条件，但更重要的是需要合适的抗原抗体分子比例。只有当二者的结合价彼此饱和时，才能连接成一个大网格样凝集物，出现凝集或沉淀。§3、抗原-抗体反应的影响因素（一）电解质 抗原和抗体有对应的极性基团，能相互吸附并由亲水性变为疏水性。电解质的存在使抗原-抗体复合物失去电荷而凝聚，出现可见反应，故免疫学试验中多用生理盐水稀释抗原或抗体。 （二）酸碱度 抗原抗体反应的最适pH是6~8。超出此范围可影响抗原、抗体的理化性状，出现假阳性或假阴性。（三）温度 适当的温度可增加抗原与抗体分子碰撞的机会，加快二者结合速度。抗体-抗原反应的最适温度为37℃。某些抗原-抗体反应有其独特的最适温度，如冷凝集素在4℃左右与红细胞结合最好，20℃以上反而解离。此外，适当震荡或搅拌也可促进抗原-抗体分子的接触，提高结合速度。（四）抗原和抗体的性质 抗体的特异性和亲和力是决定抗原-抗体反应的关键因素。从免疫早期动物所获抗血清其亲和力一般较低，而后期所得抗血清一般亲和力较高；单克隆抗体亲和力较低，一般不适用于低灵敏度的沉淀反应和凝集反应。此外，抗原理化性质、抗原决定基多寡和种类等均可影响抗原-抗体反应。 抗原和抗体的浓度、比例对抗原-抗体反应的影响最大，是决定性因素。二、抗原或抗体的检测方法§1、免疫沉淀反应 可溶性抗原（血清蛋白、病毒抗原、细胞裂解液或组织液等）与相应抗体结合，在一定条件下形成肉眼可见的沉淀物称沉淀反应。絮状沉淀1. 液相沉淀反应环状沉淀免疫浊度沉淀单向琼脂扩散试验2. 凝胶扩散沉淀双向琼脂扩散试验血清免疫电泳火箭电泳3. 凝胶免疫电泳对流免疫电泳免疫印迹等1. 液相沉淀反应1.1 絮状沉淀试验操作步骤：（1） 将可溶性抗原作一系列倍比稀释。（2） 各管加入一定浓度的适量抗血清。（3） 振摇使抗原、抗体充分混匀，置37℃孵育。（4） 产生沉淀量随抗原量而不同，以出现沉淀物最多的管为最适比例管。 絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，目前多用以测定抗原抗体反应的最适比。 1.2 环状沉淀试验操作步骤：（1） 用毛细滴管吸取抗血清加于沉淀管