第九章 验动物的胚胎工程.pptVIP

第九章  实验动物的 胚胎工程 胚胎工程（embryo engineering）是指利用人工方法影响、改变动物胚胎品质发育和进程的一种生物技术。 基本内容包括：超数排卵、胚胎培养、胚胎保存、胚胎移植、胚胎分割、性别鉴定、胚胎嵌合、细胞核移植、体外受精、基因导入以及胚胎干细胞等。 第一节 实验动物胚胎工程的基本内容 一、超数排卵 超数排卵（superovulation）：经外源激素处理的雌性动物，可以改变性周期，可以超常数的排卵，甚至可以超常数十几倍。 最高排卵量：KM小鼠，83枚/只 兔，88枚/只 金黄地鼠，72枚/只 2、超数排卵的意义 充分利用雌性动物的繁殖潜能。 在科研上可以在短时间内取得大量的卵和胚胎。 在生产中，可以提高优秀动物的繁殖数量，提高产量，增加经济效益。 二、胚胎培养 胚胎培养就是在体外仿造类似于体内条件的环境，使胚胎在体外得到与在体内一样的正常发育，这是胚胎工程研究与应用中非常重要的步骤。 早在1913年Brachet就尝试对兔囊胚进行体外培养实验，可是由于对各种动物胚胎所需的体外培养液配方不清楚，致使这方面的工作在20世纪上半世纪发展缓慢。 1957年，美国学者Whitten找到了能使小鼠早期胚胎在体外生长发育的培养液配方，从而为哺乳动物体外胚胎培养打开了一条通路。 近20多年来，世界上许多实验室均做了大量工作，发展迅速。 （二）从已有的实验结果来看，体外培养有以 下几个关键环节： 体外受精 不同时期胚胎的体外发育潜能 一定的合成培养液 一定的气相条件 1、不同时期胚胎的体外发育潜能 受精卵和早期胚胎较难培养。 例如，从猪输卵管中收集的受精卵，90%能发育到2细胞期，但很难超过4细胞期，可是从子宫中收集到的6-8细胞期胚胎，却有90%的可发育到桑葚胚或囊胚。 又如，牛受精卵6%可培养到8-12细胞期；2细胞期胚胎，则有26%可发育到8-12细胞期，8细胞期胚胎则有51%可发育到桑葚胚。 所以，在早期胚胎培养时，要牢记“受精卵和早期胚胎较难培养”的规律，务必要根据所用实验动物的不同选择特定时期的胚胎，以便成功地启动动物的胚胎培养。 2、一定的合成培养液 各种动物胚胎对培养液成分要求不同。目前常用的培养液有BMOC-3液、Whitten液、Whittingham液、Ham’s液、F10+20%小牛血清、SOF培养液、PBS+15%小牛血清、TCM-199组织培养液、M12培养液、M16培养液等。 培养液组成成分对早期胚胎发育至关重要，不同动物种类以及不同发育时期的胚胎对培养液组成成分的要求不同。 发育阻断 阶段性的胚胎培养液 早期胚胎的培养液需配合一定的气相条件。 一般用含5%CO2的空气或含5%O2和90%N2的混合气体调节PH值。 胚胎对培养液酸度变化很敏感，PH值超出7.2-7.4的范围，会引起胚胎死亡。 1、未成熟卵通过体外培养，使卵子成熟后，进行体外受精。 2、受精卵经培养成为卵裂球后，可以提供胚胎移植或冷冻保存。 3、冷冻胚胎解冻后，经过培养，然后再提供胚胎移植，可以提高 移植成活率。 4、通过胚胎培养实践，不断完善胚胎培养条件，逐步地揭示胚胎 细胞的新陈代谢、发育生长等生命活动中更深刻的奥秘。 5、导入外源基因的受精卵培养到卵裂球后再实施移植，可提高成 功率。 进行体外培养的哺乳动物胚胎，一般只是着床前的早期胚胎。 胚胎着床后，同母体建立了密切的物质交换关系，对营养条件的需求更加复杂，因此对着床后时期的胚胎体外培养更加困难。 自从开展体外培养胚胎技术研究以来，最为成功的有大鼠、小鼠和兔的胚胎培养。 小鼠胚胎培养时间最长的是Y.O.Hsu和L.T.Chen（1983）把受精后3.5天的鼠胚培养到相当于在子宫内正常发育的第10天胚胎。胚胎发育经过了原肠胚、神经胚、体节期等阶段，培养到第10天时发育出了肢芽、眼泡以及肺、肝、胰等器官。 这在哺乳动物胚胎全体外培养的道路上前进了一大步。 三、胚胎保存 保存的方法可以分为非冷冻保存和冷冻保存。 非冷冻保存是1948年，由M.C.Chang 等开创的，他们将兔2细胞胚胎，在同种血清中37℃保存48小时，移植后产仔。 非冷冻保存主要有三种方法，即异种动物体内保存法、卵和胚胎的37℃保存法和冷藏保存法 胚胎冷冻保存是指通过特殊的保护措施和降温程序,使胚胎在 -196℃条件下停止代谢, 而升温后又恢复代谢能力的一种技术。 该技术是体外受精、显微注射、转基因和克隆等胚胎生物技术的重要组成部分。 1971年Whitti