抗原抗体反应及应用7PPT.ppt

沉淀反应曲线 测定方法：在一定量的抗体中，逐渐增加抗原浓度，沉淀的形成与抗体的比例密切相关。 曲线分3个区： 抗体过量区（前带现象）：小分子复合物，不形成沉淀，。 抗原抗体等带区：大量沉淀，无游离的抗原或抗体。 抗原过量区（后代现象）：沉淀少。 抗体过量（无沉淀） 抗原抗体适量（有沉淀） 抗原过量（无沉淀） 沉淀的抗体量 抗原量 抗原抗体反应与沉淀形成 第三节 常见免疫分析方法 免疫分析方法定义：是利用抗原与抗体特异性反应的特性对抗原或抗体进行量或质的测定分析。 特点：特异、灵敏和快速。 例如： 单克隆抗体检测法可测出蛋白质的一个氨基酸的差异； 放射免疫法测定的量达到μg甚至ng的水平； 免疫沉淀法：反应时间在几小时，几分钟或更短的时间。 应用领域：医学、生命科学的几乎各个领域，甚至食品科学、环境科学、分析化学等。 一、免疫沉淀 溶液中的环状沉淀试验 在体外可溶性抗原与相应抗体形成肉眼看见的沉淀物。 在液相中形成的沉淀不容易观察判断，利用抗原和抗体溶液之间的界面形成的沉淀线便于观察。 对照 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 抗血清稀释度 抗原 沉淀线 抗血清 环状沉淀实验示意图 2. 凝胶扩散沉淀 抗原抗体在半透明的半固相介质中进行沉淀实验。抗原分子与抗体分子在凝胶介质中自由扩散，相遇形成沉淀。 以琼脂扩散实验较为常用。 单向免疫扩散：抗体混于琼脂中，小孔中加入抗原，抗原向周围均匀扩散，与抗体形成沉淀环。可用于定量测定免疫球蛋白和补体的含量等。 双向免疫扩散：抗原和抗体向周围扩散后可在两孔之间形成白色沉淀线，可用于抗原或抗体的定性检测。 缺点：时间长，灵敏度低。 沉淀线形状的变化显示抗原间是否存在共同的抗原决定簇。 3.免疫电泳 火箭电泳：单向免疫扩散与电泳结合的一种方法。在电场作用下抗原向正极扩散，与抗体形成沉淀峰（火箭型沉淀线）。需时短，能检测微量抗原。 对流电泳：在电场作用下抗原与抗体相对扩散，形成沉淀线。对流电泳较双扩快速和灵敏。 二、免疫标记 免疫标记技术：将已知抗体或抗原标记上易显示的物质（示踪物），通过检测标记物反映有无抗原抗体反应，从而间接测出微量的抗原或抗体。 目前有四种方法： 放射免疫分析法：以同位素为示踪物，为最灵敏、可靠的免疫标记技术。 酶联免疫吸附试验（ELISA） 免疫荧光技术 亲和标记的免疫分析 标记免疫技术= 抗原抗体反应 示踪物标记 灵敏性 特异性 标记免疫技术的主要特点： 高特异性、高灵敏性 免疫技术+标记技术 1.放射免疫分析法 标记同位素：125I，131I、3H和35S 检测方法： 液相体系用液体闪烁仪计数； 固相体系用X射线胶片显影。 直接法与竞争法 检测 检测 竞争法基本原理 采用定量的标记抗原（Ag＋）和非标记抗原（Ag）竞争性结合有限量特异性抗体（Ab）的反应。 放射活性 放射活性 抗原浓度 抗原浓度 放射性同位素标记分析法示意图 直接法 竟争法 放射性同位素标记分析法示意图 2.酶联免疫吸附试验（ELISA） ( enzyme linked immunosorbent assay) (1) 定义：抗原与抗体吸附在固相表面，如聚苯乙烯微量板，抗原与抗体反应后，将固相与液相分离除去游离的抗原或抗体，而结合的抗原或抗体上被标记的酶仍保持活性，催化底物形成有色产物。 (2) 测试方法：可目测或用分光光度计比色进行定性或定量检测。 (3) 测试过程 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性（固相抗原／抗体的形成） 在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应（抗原抗体反应） 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。（酶标抗原抗体复合物的分离） 加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。（显色反应） 酶 来源 底物 检测波长/nm 碱性磷酸酶 牛小肠黏膜 对硝基酚磷酸盐 405 过氧化物酶 辣根 邻苯二胺/过氧化氢 492 β-半乳糖酶 大肠杆菌 对硝基酚β-半乳糖 405 常用标记的酶及其底物 (4) ELISA技术类型 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，在这种测定方法中有3种必要的试剂： 固相的抗原或抗体， 酶标记的抗原或抗体， 酶作用的底物。 ①双抗体夹心法(直接夹心法） 特点： 非竞争结合反应 常用于抗原的检测 适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子