流式细胞技术课件PPT.ppt

第15章 流式细胞技术的原理和应用;流式细胞技术（Flow cytometry, FCM) 是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速对单个细胞或其他生物微粒（如细菌）的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。;30年代：设想使细胞检测自动化 50- 60年代：分层鞘流原理、分光光度计定量细胞成分及结合测量值对细胞分类，提出细胞分选 70年代：单克隆抗体技术和荧光标记技术 1973年：第一台商用流式细胞仪FACS I 发展方向：荧光染料的开发、细胞的制备方法、提高电子信号的处理能力等;BD公司流式细胞仪;MoFlo Astrios EQ 超高速流式分选系统;应用：细胞生物学，肿瘤学，血液学，免疫学，药理学，遗传学及临床检验学等;液流系统 光学系统 数据处理系统;由样本和鞘液组成 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。 ;;样本管;激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光），FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）;光学系统示意图;散射光的测定 细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。; 前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°~10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。; 侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。; 测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。 此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。;荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。 ???种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。 线性放大器和对数放大器;;荧光补偿;细胞悬液形成液流柱;分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。;（3）数据处理系统;由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。 ;双参数点图;; 用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相同，不同的等高线上细胞数不同。;三参数直方图;多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。 一般利用所得参数的两两组合并利用设门（Gate)技术，来分析参数之间的相互关系。 ;Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。;A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞;区阈（region, R）与门(gate, G ) 是两个相关的概念，区阈可与门对应，但是也可以包含于门。;样本制备：单细胞悬液 标记染色：光谱不重叠 阴性对照的设置：检测标本的重复性 质量控制 ;外周血淋巴细胞样品的制备：淋巴细胞分离液分离外周血中单个核细胞。Ficoll，40kd，高密度，低渗透压，无毒性。（比重为1.0177±0.001的分层液);培养细胞的样品制备：单层培养细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法使细胞从培养皿上消化下来，然后离心漂洗。 悬浮培养细胞，可不用酶消化，直接吹打制备成单细胞悬液。 新鲜实体组织单细胞悬液的制备 机械法：剪碎法、网搓法、研磨法。 酶处理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶等。 化学试剂处理法：EDTA、EGTA等。 表面活性剂处理法：Triton-x100、皂素等。 ;防止细胞自溶，保持细胞膜原有的特性保存的方法： 1、深低温保存法：深低温冰箱，保存一年。 2、乙醇与甲醇保存法：70%冷乙醇、75%的甲醇。 3、甲醛或多