生物分子的分离纯化-2011PPT.ppt

Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 蛋白质分离纯化的一般技术路线 分离纯化的总体原则 一是保证靶蛋白结构的完整，防止降解和活性蛋白质的变性； 二是尽量满足研究与诊断对靶蛋白纯度的要求。纯化蛋白质总是希望纯度和产率均高，例如纯化某种酶，理想的结果是比活力和总回收率均高，但实际工作中二者不能兼得，通常在科研上希望比活力尽可能高，而牺牲一些回收率，在工业生产和分子诊断中则正相反。 蛋白质分离纯化的条件 蛋白质是一类结构复杂、有生物活性的生物大分子，离开天然的存在体系，其结构与活性变得极不稳定，因此从生物材料中提纯各种靶蛋白均需要特定的条件。应注意各种因素对靶蛋白的影响。 基因组DNA－其它方法 　物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 　化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 　生物方式：酶法 　根据细胞裂解方式的不同有： 基因组DNA－其它方法 　吸附材料结合法： 　根据核酸分离纯化方式的不同有： 　硅质材料 　 　阴离子交换树脂 　磁珠 高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱 快捷高效。 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱 适用于纯度要求高的实验。 磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。 基因组DNA－其它方法 　浓盐法： 　　　　 　有机溶剂抽提法： 　　　　 　密度梯度离心法： 　　　　　　　 利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离 有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用 利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物 基因组DNA片段的纯化 纯化的原则与要求 纯化的方法有透析、层析、电泳及选择性沉淀等。无论采用何种方法从何种支持介质中纯化与回收所需要的DNA片段都要注意两个原则： 一是提高片段的回收率； 二要清除回收的DNA样品中的污染。 回收率 为提高DNA片段的回收率，可通过提高DNA样品的上样量和选择适宜的方法与材料而实现。 2. 纯度 常用的纯化方法包括有机溶剂抽提法与商品化的柱层析法（column chromatography）。 柱层析法采用的是阴离子交换层析的原理 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段 从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段的方法主要有 二乙基氨基乙基（diethyl aminoethyl，DEAE）-纤维素（cellulose）膜插片电泳法 电泳洗脱法（透析袋及非透析袋电泳洗脱法） 冷冻挤压法 低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法等。 从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段 从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA的标准方法是压碎与浸泡法。它是将含待回收DNA条带的凝胶块切出，用吸头或接种针将其压碎，然后以洗脱缓冲液浸泡，使DNA洗脱出来。 该方法能很好地回收小于1 kb的ss或ds-DNA，依分子量不同，其回收率从小于30%至大于90%不等。回收的DNA纯度极高，无酶抑制剂，也无对转染细胞或微注射细胞有毒的污染物，虽费时但操作简单，是小片段DNA回收的较好方法。 质粒DNA的提取与纯化 质粒DNA的提取与纯化的经典方法包括： 碱裂解法 煮沸裂解法 SDS裂解法等 这些方法主要由质粒DNA的扩增、质粒DNA的释放、质粒DNA的分离纯化三个步骤组成 1、碱裂解法 在NaOH提供的高pH（12.0～12.6）条件下，用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性，释放出质粒DNA。 质粒DNA－碱裂解法 　碱裂解法原理 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。 尽管碱溶液能破坏DNA中的碱基配对，但CCC质粒DNA因缠绕紧密而不易解链，只要不在碱性条件下变性太久，当pH调至中性时，CCC质粒DNA就可重新恢复天然的超螺旋。 该法操作简单、重复性好且成本低，制备的质粒纯度能满足DNA测序与PCR等实验要求，是使用最广泛的方法 质粒DNA－碱裂解法 　碱裂解法流程图 对数期菌体 溶液III中和 溶液I充分重悬 溶液II裂解 上清液 抽提 离心洗涤 酒精沉淀 干燥溶解 沉淀 质粒DNA溶液 2、SDS裂解法 SDS裂解法是将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，去壁细菌再用SDS裂解，从而温和地释放质粒DNA到等渗液中，然后用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒DNA 由于条件温和，该