生物化学 第14章 基因重组和基因工程(临本)PPT.ppt

1、显微注射法 (Microinjection technique) 在显微镜下，用一根极细的玻璃针（直径1-2微米）直接将DNA注射到胚胎的细胞核内，再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。用这种方法生产的动物约有10%是整合外源基因的转基因动物。 2、电穿孔法 在高压电场的短暂作用下，细胞膜上可出现可逆的孔洞，外源DNA可通过此孔洞进入胞内。 方法适应不同细胞如细菌、酵母、植物及动物细胞。 需电穿孔仪。 3、DNA-磷酸钙共沉淀法 将DNA与CaCl溶液混合，再缓慢滴加入含有磷酸的HEPES溶液中，形成DNA-磷酸钙共沉淀颗粒。 小心地将颗粒加入到培养的靶细胞表面，保温数小时后，使DNA被靶细胞摄取。 更换培养液使外源DNA在细胞中表达，筛选转化细胞或分析外源基因的表达量。 4、DEAE-右旋糖苷法 该法先用来促进病毒DNA导入，后来发展为一种哺乳动物细胞的基因转移方法。 方法：用外源DNA和DEAE-右旋糖酶的混合物处理细胞。 通常只用于克隆化基因的瞬间表达，不用于细胞的稳定转化。它对BSC-1，CV-1和COS细胞转染较好，因此应用上有限制。 5、逆转录病毒载体 逆转录病毒是一种RNA病毒，基因大小为3-10kb。不同于其它病毒，它具有二倍体基因，即含有两个相同的RNA分子，有典型的真核mRNA结构（包括帽子和尾巴）。 1. 直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法:原位杂交、Southern印迹等。 2. 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等 （五）重组体的筛选 (插入失活法) 抗药性标记选择 带有双抗生素的质粒自身环化在两种抗生素培养基上都生长，DNA重组体只能在其中一种抗生素培养基上生长。 组氨酸缺陷 型大肠杆菌 无组氨酸 的培养基 酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因 促进组氨酸合成 λDNA 重组体 标志补救 α互补原理筛选重组体pUC18 如果无外源基因插入：则质粒lacZ基因正常表达和宿主菌的lacZ基因互补，产生有活性的β –半乳糖苷酶，经IPTG诱导后，分解X-gal底物，产生blue clony。 如果有外源基因插入：则质粒编码的lacZ基因失活、菌体不可能互补产生β–半乳糖苷酶，产生white clony。 原位杂交 Southern印迹 鸡的β肌球蛋白的克隆和检出 免疫学方法 重组DNA技术操作过程可形象归纳为： 小结 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体细胞 筛 筛选重组体 克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。 常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA 载体的选择标准： 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 1. 质粒 (plasmid): 特点: 能在宿主细胞内自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。 是存在于细菌染色体外的具有自主复制能力的小型环状双链DNA分子。 最早使用的质粒DNA是人工构建的pBR322，该质粒分子大小为4.3kb，带有抗四环素和抗氨苄青霉素基因，含EcoRⅠ，BamHⅠ，HindⅢ等单一的限制酶切位点。 2.噬菌体(bacteriophage，phage) 噬菌体是感染细菌的一类病毒，因其寄生在细菌中并能溶解细菌细胞，故称为噬菌体。 噬菌体由头和尾构成，感染时尾管将基因组DNA注入大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。 具有溶菌性和溶原性两种不同的繁殖方式。 λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型载体，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型载体，适用基因组克隆） M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列 由λ噬菌体的cos区与pBR322质粒组合的杂种载体。粘粒可克隆29-45kb的大片段，常用作建立真核基因组文库的载体。 粘粒(cosmid) 3.病毒（virus） 病毒载体更多用于真核表达系统，如腺病毒，腺病毒相关病毒、痘病毒，逆转录病毒，猴空泡病毒等。 酵母人工染色体 (yeast artifi