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Seminar II 生物大分子的识别、分离和检测 Seminar II 内 容 生物大分子 识别 分离与检测 生物大分子 生物大分子是指分子量大于10，000，有复杂空间结构，具有生物活性的物质，如多肽、蛋白质、酶等。 特性：具有特定的生化结构（组成，序列和构象），分子量大，分子极性强，对温度、pH值、剪切力、有机溶剂等非常敏感。 生物大分子的识别 “看清”生物大分子“是谁”； “看清”生物大分子“是什么样子”。 质谱测定分析—— 一种识别生物大分子的方法 质谱测定分析法是通过测定样品中物质的质量来识别物质的类别。 传统的质谱分析方法是：首先将成团的蛋白质分子拆分成各自独立的单个分子，将其电离并使之悬浮在真空中，然后让它们在电场作用下运动。 这种方法的缺点在于生物大分子比较脆弱，在拆分和电离成团的生物大分子过程中它们的结构和成分很容易被破坏。 芬恩的电喷雾质谱技术（ESI）原理图 田中耕一的软激光解吸附质谱技术（RLD）原理图 质谱测定方法解决了“看清”生物大分子“是谁”的问题 核磁共振—— 一种揭示生物大分子真面目的方法 在核磁共振技术出现以前，X射线晶体分析技术是惟一可以研究蛋白质三维结构的方法。该法是根据蛋白质结晶对X射线的衍射作用实现的。但该法不能对溶液进行分析。 核磁共振技术弥补了X射线晶体分析技术的不足，能够对溶液中的蛋白质进行分析，即在蛋白质最自然的生存环境下对它们进行研究，进而得到“活”蛋白质的结构。 朊病毒蛋白质分子中肽链有一半（23-120）在水溶液中是呈现无规则的、松散的、灵活多变的状态。 应用核磁共振技术测定的朊病毒蛋白质分子结构图 在结晶状态下蛋白质分子是紧紧地积压在一起的，而在溶液中它们则处在最自然的生理状态下。 国外科技动态，2002，11， 8 核磁共振法独到之处是测定溶液中的蛋白质，是在最接近分子自然生理状态的条件下进行测定。 维特里希设计了一套将核磁共振信号与生物大分子中的质子相对应的系统分析方法。他进一步说明这些质子间的距离如何确定，再结合距离几何学的数学方法就可获得大分子清晰的三维结构图。 瑞士科学家库尔特?维特里希，获2002年诺贝尔化学奖 如果确定了一座建筑物的所有工程数据，就可以快速而准确地绘出该建筑 物的三维结构图。 如果知道蛋白质分子中大量折叠片段间的距离，也就知道了它的三维结构图。 核磁共振技术方法解决了“看清”生物大分子“是什么样子”的问题 生物大分子的分离与检测 生物大分子通常来自天然产物或发酵液中，并以混合物、低浓度的状态存在。 除了分子量大，还具有结构复杂（具三级或四级结构），具有生物活性，一旦条件不适合就丧失活性，因此在分离技术上与一般的小分子有机物的分离有差别。 色谱法 由液相色谱、气相色谱和毛细管电泳等所组成的色谱学是现代分离、分析的主要组成部分。 液相色谱与毛细管电泳技术是目前已知的两种最有效的分离生物大分子的方法。 但毛细管电泳不仅处理量小而且在分离过程中会破坏生物大分子的构象、降低其生物活性。 液相色谱一般在室温下进行，所用流动相为液体，固定相的表面经过各种化学修饰，能为生物大分子的分离提供“软接触”的温和相互作用，因此成为分离生物大分子强有力的手段。 液相色谱 开发新型固定相 大孔填料（孔径为30-50nm） 无孔填料（粒径1-3μm） 膜色谱基质 整体材料固定相 建立多维分离模式 膜色谱技术 膜色谱技术是液相色谱合膜分离相结合的一种新技术，融合了二者之长，具有快速、高效、高选择性、易于放大等特点，能满足生物大分子高效分离与纯化的需要。　 膜色谱采用具有一定孔径的膜作为介质,连接配基,利用膜配基与生物大分子之间的相互作用进行分离纯化. 当料液以一定流速流过膜的时候,目标分子与膜介质表面或膜孔内基团特异性结合,而杂质则透过膜孔流出,待处理结束后再通过洗脱液将目标分子洗脱下来,其纯化倍数可达数百乃至上千倍. 膜科学与技术，2001，21，66 膜色谱特点为: 优点： (1) 生物大分子在膜介质中以对流传质为主，分离速度快，特别适用于生物大分子的快速分离； (2) 柱压低； (3) 易于放大，只要简单的增加柱长就可以达到目标； (4) 可直接处理复杂的生物样品，几乎不需要与处理； (5) 膜基质生物兼容性好。 缺点： (1) 柱效低 (2) 耐压性差 整体柱固定相 传统大孔球形色谱填料的缺点： 1、传统填充柱的空间占用率低。 2、微球表面孔内停滞流动相的传质阻力是影响柱效，导致峰形变宽的主要因素。 20世纪80年代末发展了一种新型填料合成技术：通过在空管柱中加入单体、引发剂及致孔剂的混合溶液“原位”聚合制得整体柱。 1 S