第5章 表达载体2014PPT.ppt

第五章 表达载体;表达载体构建的一般原则 1、阅读框架 要使目的基因得以表达，最重要的因素是外源目的基因本身必须置于正确的阅读框架之中。 用人工接头可以调节阅读框架，选择适当的人工接头，就可使外源基因处于正确的阅读框架中。;2、启动子（关键因素） 有效的转录起始是外源基因能否在宿主细胞中高效表达的关键步骤之一。 因此，选择强的启动子及其相关的调控序列，是构建一个高效表达载体首先要考虑的问题。; 3、转录的有效延伸和终止 外源基因的转录一旦被起始，接下来的问题是如何保证mRNA有效地延伸、终止。 转录衰减和非特异性终止可诱发转录提前终止。 措施： （1）除去衰减子 （2）插入抗转录终止序列 （3）强转录终止序列;4、有效的翻译起始（关键因素） 原核：SD序列，能帮助从起始AUG处开始翻译。 真核：kozak（科扎克）序列，核糖体能够识别mRNA上的这段序列，并把它作为翻译起始位点。 5、翻译终止密码选择 在原核生物中，翻译的终止由两个释放因子所控制，RF1识别UAA和UAG，RF2识别UAA和UGA。由于UAA为两个释放因子所识别，因此在基因工程中，一般采用UAA作为终止码。;总之，构建表达载体应根据表达体系的特性，选择性地应用上述原则，删除降低外源基因表达的一些元件，插入提高外源基因表达的一些必需元件。;大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA(美国食品药物管理局)批准为安全的基因工程受体生物;大肠杆菌表达外源基因的劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素;*;*;2、表达形式 完整单一蛋白：单一基因的编码区表达。 融合蛋白(fusion protein)：多个基因的编码区的串联体，但构成一个整体的单一ORF，如果融合标签蛋白有利于蛋白的定向、纯化，如果融合多个目标蛋白，则类似于直接表达了一个多酶复合体一样，可减少??体构建难度，而且可以偶连两个或多个相关基因的表达。;*;二、利用T7噬菌体启动子的表达载体 大肠杆菌 T7 噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为 T7 表达系统。 ; T7 表达系统 T7噬菌体基因1编码的T7 RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。 T7 RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。 ;T7 表达系统转录调控的机理 T7 噬菌体启动子的转录完全依赖于 T7 RNA 聚合酶，因此 T7 RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。 化学诱导型 温度诱导型 双质粒系统;化学诱导型 噬菌体 DE3 是λ噬菌体的衍生株，一段含有 lacI启动子和T7 RNA 聚合酶基因的DNA 片段被插入其中。 用噬菌体DE3的溶源菌作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学诱导型，类似于 Lac 表达系统。;温度诱导型 PL 启动子控制T7 RNA 聚合酶基因，通过热诱导方式激发T7 噬菌体启动子的转录。 这种方式可以使本底转录降到很低的水平，尤其适用于表达对大肠杆菌宿主有毒性的重组蛋白质。 ;双质粒系统 一个质粒带有 T7 RNA 聚合酶基因，另一个质粒带有 T7 启动子和目的基因 两个质粒的复制子和抗性标记不能相同，调控方式为控制 T7 RNA 聚合酶的启动子调控类型;T7 表达系统存在的问题 T7 表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的，但也不可避免出现在相对较高的本底转录，如果目的基因产物对大肠杆菌宿主有毒性，会影响细胞的生长。 解决办法 在表达系统中低水平表达 T7 溶菌酶基因，能与T7 RNA 聚合酶结合抑制其转录的活性。通过共转化质粒导入表达系统，它能明显降低本底转录。 ;表达融合蛋白有下列优点： (1)转录和翻译起始从正常的E. coli序列开始，故通常可以产生高水平的融合蛋白。 (2)融合蛋白往往比天