第6章 核酸的分离与纯化PPT.ppt

第六章 核酸的分离与纯化 ;第一节 核酸分离与纯化的设计与原则 ; 核酸的存在形式（DNA） ; 核酸的存在形式（RNA）;一、材料与方法的选择 ;（三）影响核酸完整性的因素 ;二、技术路线的设计 ; (二)核酸的分离与纯化 ;核酸与其它物质的差异 ;应该去除的污染物 ;(三) 核酸的浓缩、沉淀与洗涤 ;三、鉴定与保存 ;(二)核酸的保存---DNA的保存 ;(二)核酸的保存---RNA的保存;核酸小量分装保存： 由于反复冻融产生的机械剪切力对DNA与RNA核酸样品均有破坏作用，在实际操作中，最好将核酸小量分装保存。 ;第二节 基因组DNA的分离与纯化 ;EDTA：为二价金属离子整合剂，可以抑制DNA酶的活性，同时降低细胞膜的稳定性。 SDS：为生物阴离子去污剂，主要引起细胞膜的降解并能乳化脂质和蛋白质。并使它们沉淀，同时还有降解DNA酶的作用。 无DNA酶的RNA酶：可以有效水解RNA而避免DNA的消化。 蛋白酶K：有水解蛋白质的作用，可以消化DNA酶和细胞中的蛋白质。 酚：可以使蛋白质变性沉淀，也抑制DNA酶的活性。 pH8.0的Iris溶液：能保证抽提后DNA进入水相，而避免滞留于蛋白质层。 ;(二)甲酰胺解聚法 ;(三)玻棒缠绕法 (四)其它方法 异丙醇沉淀法： 玻璃珠吸附法： 各种方法的取舍、蛋白酶K与RNA酶的使用与否要根据需要小心选择。 ; 碘化钾法抗凝血DNA提取（遗传中心） ↓取抗凝血500μl于1.5ml EP管（4管） ↓加重蒸水至1500μl ↓8000r/min 离心3min，弃上清（4管白细胞合并） ↓加80μl 5mol/L KCl，旋涡振荡30S ↓加9g/L NaCl400μl，混匀 ↓加600μl氯仿，旋涡振荡30S ↓10000r/min离心5min，取上清400μl ↓加异丙醇240μl ↓40C 10000r/min离心12min，弃上清 ↓500μl 4℃ 无水乙醇洗一次 ↓40C 10000r/min离心5′，弃上清 ●擦干,37℃干燥2-3min，80μl 1×TE混匀溶解配备。 ;(五)DNA样品的进一步纯化 ;二、DNA片段的回收 ;三、基因组DNA分离纯化的 方法学评价与质量保证 ;第三节 质粒DNA的提取与纯化 ;质粒DNA的纯化 ;二、质粒DNA的回收 常通过凝胶电泳分离并回收。有关回收方法与本章第二节中DNA片段的回收方法相同。 三、质粒DNA提取纯化的方法学评价与质量保证 (一)方法学评价 (二)质量??证 ;第四节 RNA的分离与纯化 ;一、RNA制备的条件与环境 ;3、防止RNase对RNA的水解原则：;二、总RNA的分离与纯化： ;三、mRNA的分离与纯化 ;本章总结 ●核酸分离与纯化的设计与原则： 核酸一级结构的完整性； 尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度。 ●影响核酸完整性的因素： 可以避免的有害因素：过酸或过碱、高温加热 无法避免的有害因素：步骤、时间、核酸酶 ●技术路线的设计： 核酸的释放、 核酸的分离与纯化、 核酸的浓缩、沉淀与洗涤 ;●鉴定与保存： 浓度鉴定、纯度鉴定、完整性鉴定 紫外分光光度法、荧光光度法 ●基因组DNA的分离与纯化： 酚抽提法、 甲酰胺解聚法、 玻棒缠绕法 其它方法 ●质粒DNA的提取与纯化 ●RNA的分离与纯化： RNA制备的条件与环境、 防止RNase对RNA的水解原则 ;作业