第七章 核酶工程PPT.pptVIP

端粒酶活性分析作为肿瘤诊断指标的另外一个优点是在某些肿瘤类型，恶变前端粒酶已被激活，随着肿瘤进展，端粒酶活性逐渐上升 端粒酶活性监测可作为早期诊断或预警的一个指标。如在宫颈部位，从宫颈上皮内增生到出现明显症状的肿瘤这一过程，是与端粒酶活性的上升密切相关的。在前列腺肿瘤形成过程中也有类似情况，从出现良性增生到前列腺癌变的整个进展过程，端粒酶活性一直上升 端粒酶活性也是肿瘤患者预后评估的良好指标，如胃癌患者，端粒酶往往与肿瘤尺寸，转移情况和患者存活时间相关 　　　另外，在白血病、脑脊瘤和乳腺癌患者，端粒酶往往与肿瘤大小、转移情况、存活时间相关。端粒酶活性高预后不良，端粒酶活性越高，预后越差。 端粒酶还作为肿瘤治疗的作用靶位，从最先发现瑞粒酶可延仰端粒长度起，就认为端粒酶抑制剂可阻止细胞的恶性分裂增殖，因而有可能用于抗肿瘤。 近来对以端粒酶为作用靶点的抗肿瘤研究非 活跃。 代表性的研究方向有 1.阻断端粒酶RNA的模板作用来抑制端粒酶活性（比如通过反义核酸技术或构建锤头状核酶破坏端粒酶RNA的模板功能 ） 2.逆转录酶抑制剂 3.核苷酸类似物 4.蛋白激酶C抑制剂 5.细胞分化诱导剂 前4种途径因作用太广泛，特异性不高，毒副作用 明显，进展不大。 其中细胞分化诱导剂抑制端粒酶活性的研究是进展最明显的。为了确定永生化细胞的表型分化是否与端粒酶活性调控有关。 组I内含子和组II内含子 组I内含子（group I intron）和组II内含子（ group II intron ）这类核酸比较复杂，通常包括200个以上的核苷酸，主要催化mRNA前体的拼接反应。 组I内含子核酶催化反应可以在体外无蛋白质参与下除掉自身内含子，包括两个连续的转酯反应，并且需要Mg2+或Mn2+及鸟苷（或鸟苷酸）的参与 组I内含子还可催化各种分子间反应，包括剪切RNA和DNA、RNA聚合、模板RNA连接等 组I内含子和组II内含子的主要差别是第一步反应的化学机制，在I中，外部的鸟苷的3’-羟基作为进攻基团，而在II中，是内部腺苷的2’-羟基起作用 组I内含子和组II内含子的剪切机制如图7－4所示 第二节 功能性核酸的体外选择 体外选择（invitro selection）或指数扩增法系统进化配体（systematic evolution of ligands by exponential amplification, SELEX）是从顺序随机的RNA或DNA分子构成的大容量随机分子库出发，在其中筛选得到极少数具有特定功能的分子。 这些技术拓宽了对核酸分子催化能力的认识，同时提供了新型的医疗诊断试剂。 功能性核酸筛选的基本思想 在一个顺序随机的RNA分子库中，通过一定的筛选方法，得到极微量的具有某种功能（切割或连接核酸分子、与配体结合等）的RNA分子，然后用RT－PCR将这些微量到难以检测的分子扩增，再对PCR产物进行序列分析以及其他各种性质的测定。 利用待筛选分子的可遗传特性，将分子的基因型和表现型联系起来，在筛选得到具有目的性质的表现型的同时也获得了可以体现这种性质的基因型。 对RNA和靶分子的结合能力的筛选 最早体现这种筛选思想的是20世纪60年代利用RNA噬菌体Q进行的实验，该病毒的基因组可以在体外被Q复制酶扩增。该实验的另一个先进思想是通过在体外反应体系中加入EB或改变四种dNTP的浓度来增加基因组复制过程中的突变率。 用化学法合成的DNA分子可以在其链的任何位置上引入完全随机的顺序；反转录酶和PCR技术的应用使人们可以在体外条件下不必依靠Q复制系统就能很容易的扩增出几乎任何的核酸系列。 所有这些开发出多种RNA分子的体外选择和定向进化方法，为获得新功能的RNA创造了条件。 RNA适体 在体外选择中得到的可以与目标分子结合的RNA分子称为目标分子的RNA适体（aptamer）。 适体是能与有机物或蛋白质等配体专一、高效结合的RNA或DNA片段，分别称为RNA适体或DNA适体 。筛选一种适体的一般方案如图7－5所示。 功能性核酸通常含有若干构成保守的二级结构的长度比较小的功能中心序列，这些序列由长短不一、顺序不同的突环（loop）连接。这些环状结构不论在长短还是碱基配对方面均可承受一定的变化，而不显著影响功能性核酸的活性，这就是功能性核酸顺序的冗余性。 适体的选择 适体虽然不是酶，但是筛选原理也与核酶的基本一样。另外适体可以作为核酶的底物结合模块或者辅助因子结合模块被引入到核酶中，同时适体本身也具有很大的应用价值。 有些结构更为简单的适体同样具有与相应配基的高度亲和力，如黄素单核苷酸与托普霉素的RNA适体（图7－6） 通过体外选择