第三章蛋白质一级结构的测定PPT.ppt

（三）特殊氨基酸的测定： 1.Trp的测定： 酸水解时易破坏，可以在酸水解液中加入2-4%的巯基乙酸来提高Trp的收率（90%），或直接改用碱水解，再用标准氨基酸柱层析法进行分析。 (1) 紫外吸收法： 将蛋白质样品溶于6mol/L的盐酸胍溶液中，然后测定蛋白质溶液在280nm和288nm的光吸收。根据下面的公式来计算Trp的残基数： (2)对-二甲基氨基苯甲醛法： Trp在强酸下与醛反应生成有色产物，其颜色深浅与Trp含量呈正比，在590nm有最大光吸收。 半胱氨酸可与二硫硝基苯甲酸（dithionitrobenzoic acid，缩写为DTNB）　　或称Ellman氏试剂发生硫醇-二硫化物交换反应： ????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 　　反应中1分子的半胱氨酸引起1分子的硝基苯甲酸的释放。它在pH8.0时，在412nm波长处有强烈的光吸收，因此可利用比色法定量测定-SH基。 ? 半胱氨酸可与二硫硝基苯甲酸（dithionitrobenzoic acid，缩写为DTNB)或称Ellman氏试剂发生硫醇-二硫化物交换反应 反应中1分子的半胱氨酸引起1分子的CNT的释放。在412nm波长处有强烈的光吸收，因此可利用比色法定量测定-SH基。 2.巯基的测定（硫醇盐法、烷基化法、比色法） 简单易行的比色法：试剂与巯基反应生成带色产物。 R-S-S-R（E-S-S-E,DTNB）： 5、5?-二硫代双（-2-硝基苯甲酸） RS-（E-S,CNT）： 4-硝基-3-羧基硫酚 Ellman法：前提是有游离的-SH存在， Ellman试剂与二硫键发生反应。(如果蛋白质中没有活泼的巯基，可加入巯基化合物，如cys、谷胱甘肽和二硫苏糖醇，以便启动这个反应。) 二硫键的数目= （pH10.5测得的CNT数）-2（ pH10.5前测得的CNT数） 2 3.二硫键的测定 游离巯基启动 1、自由氨基酸重量/蛋白质重量X100% 2、氨基酸分子数（氨基酸残基数）/蛋白质分子数 3、氨基酸残基重量/蛋白质重量X100% 4、氨基酸含N摩尔数/蛋白质含N摩尔数(含N百分率) (四) 蛋白质中氨基酸组成的表示方法 例子： 已知胰岛素分子量为5734，Asp的分子量133.11，将1720?g胰岛素纯品彻底水解，得到Asp0.91?mol,Ser0.87 ?mol, Lys0.31 ?mol,Arg0.3?mol.请用不同的方式表示胰岛素中氨基酸的组成。 1、自由氨基酸重量/蛋白质重量X100% 自由Asp的重量=133.11?0.91=121.1 ?g，所以自由Asp的百分率= 121.1 / 1720=7.06% 2、氨基酸分子数（氨基酸残基数）/蛋白质分子数 胰岛素分子数= 1720 ?g?5734=0.3 ?mol，所以，胰岛素中Asp残基数= 0.91?mol ? 0.3 ?mol=3.03个，即3个。 3、氨基酸残基重量/蛋白质重量X100% Asp残基百分率= （133.11-18）?0.91/ 1720=6.15% 4 、氨基酸含N摩尔数/蛋白质含N摩尔数 Asp含N摩尔数=0.91 ? 1 ?mol，胰岛素含N摩尔数=0.91 ? 1+0.31 ? 2+0.3 ? 4+0.87 ? 1….=19.53 ?mol 所以Asp含N百分率= 0.91 ? 1 / 19.53 =4.66% (五)蛋白质营养价值的评价 必需氨基酸：人和非反刍动物体内不能合成，必须由 食物中吸取，以保证正常生命活动。 Ile Met Val Leu Trp Phe Thr Lys （Arg His）(10种) 一 家 写 两 三 本 书 来 半必需氨基酸： Arg His在人体中合成比较慢，不足以满足需要，也需要从食物中吸取。 限制性氨基酸：食物中含量低于标准水平的必需氨基酸称为限制性氨基酸。一般食物中的限制性氨基酸是 Lys Trp Met 即使其它必需氨基酸比例适当，但由于限制性氨基酸的存在，从而影响到蛋白质的营养价值。 评价蛋白质营养价值的指标 氨基酸分数（A.A.S）： 氨基酸分数=1克待测蛋白质中某种必需氨基酸的mg数/ 1克标准蛋白质中（牛奶、鸡蛋）某种必需氨基酸的mg数?100% 比值越接近100%，营养价值越高。一般只测Lys Trp Met。 表示食物中蛋白质利用效率的