第五章 酶分子修饰PPT.pptVIP

Chapter 5 Modification of Enzyme Molecule;酶分子修饰的产生; 酶在使用中的缺陷有：稳定性差、活力不够高、抗原性等，如对酸、碱、重金属、有机介质、高温等物理化学环境敏感，且活性、专一性、作用条件不能满足生产工艺要求。 酶分子修饰成为酶工程中具有重要意义和应用前景的领域。 随着蛋白质工程的兴起与发展，酶分子修饰与基因工程技术结合在一起，使酶分子修饰展现出更广阔的前景。;Contents of chapter 5;5.1 什么是酶分子修饰？;5.2 酶分子修饰的基本要求和条件 ;酶分子修饰的条件;5.3 酶分子的修饰方法 ;第一节 金属离子置换修饰;若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。 如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。 若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。 有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。;一、金属离子置换修饰的方法 ;;二、金属离子置换修饰的作用;第二节 大分子结合修饰;用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。 例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 ，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。;每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍； 每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍 ;一、大分子结合修饰的方法;一、大分子结合修饰的方法;;二、大分子结合修饰的作用;修饰的作用;2、通过修饰增加酶的稳定性 酶的稳定性用半衰期（指酶的活力降低到原来活力一半时所经过的时间）表示。 水溶性大分子---修饰 在酶分子外围形成保护层 水不溶性大分子-----制成固定化酶 ;例如： SOD能清除体内的超氧负离子，受到医药界的极大关注。但是不容易进入细胞内，在体内的作用时间短等因素限制了SOD的应用。 Beckman等利用PEG修饰SOD使其在血液中的半衰期由几分钟提高到数十小时，降低了抗原性，提高了对胰蛋白酶的消化抵抗功能。 ASNase用聚丙氨酸修饰，热稳定性大大提高。;天然SOD与修饰后SOD半衰期比较; ;精氨酸酶经PEG结合修饰后，其抗原性显著降低。 色氨酸酶经PEG修饰后，完全消除该酶的抗原性。 ;第三节 侧链基团修饰;;催化活性/非催化活性基团的修饰;常用的化学修饰剂及修饰方法 一、氨基修饰剂： 定义：凡能使酶蛋白侧链上的氨基发生改变的化合物。 原理：这类试剂作用于酶蛋白侧链上的氨基或产生脱氨基，或与氨基共价结合将氨基屏蔽起来，使氨基原有的副键改变，从而改变酶蛋白的构象。 主要有：二硝基氟苯、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、亚硝酸、乙亚胺甲酯、O-甲基异脲、顺丁烯二酸酐等。 ;一、氨基;二、羧基修饰剂： 定义：可与酶蛋白侧链上的羧基反应的小分子化合物。 原理：可使羧基酯化、酰基化或结合生成其他物质，改变酶蛋白的空间构象，从而改变酶的催化特性。 主要有：乙醇-盐酸试剂、水溶性的碳化二亚胺等。 ;二、羧基; 三、巯基修饰剂： 原理：半胱氨酸残基侧链中含有巯基。许多酶分子中存在的巯基通过形成二硫键维持蛋白质分子的三维构象，对维持酶的结构稳定性起重要作用。 常用试剂：巯基乙醇、二硫苏糖醇、硫代硫酸盐、硼氢化钠等。 ; 四、胍基修饰剂： 原理：精氨酸含有胍基。二羰基化合物可与胍基缩合生成稳定的杂环。 主要有：环己二酮、乙二醛、苯乙二醛等 ;四、胍基; 五、酚基修饰剂： 原理：酪氨酸残基上含有酚基。经酚基修饰剂修饰后，酶分子由于引入负电荷，增加了对带正电荷底物的结合力，有利于酶催化功能的发挥。修饰酚基的方法有：碘化法、硝化法、琥珀酰化法等。 主要有：四硝基甲烷 ;五、酚羟基;六、咪唑基;七、色氨酸吲哚基; 八、分子内交联剂： 原理：用含有双功能团的化合物，与酶分子内两个侧链基团反应，在分子内共价交联，可使酶分子空间构象更加稳定，从而也使酶的催化稳定性增加。 主要有：戊二醛、二氨基丁烷、已二胺等。 ;;;第四节 肽链有限水解修饰 (酶蛋白主链修饰);;b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活 ;c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活 ;;;;思考：;第五节 核苷酸链剪切修饰;第六节 氨基酸置换修饰;例如： 酪氨酰-tRNA合成酶可催化酪氨酸和其所对应tRNA，若将该酶第51位的苏氨酸由辅氨酸置换，经修饰后的酶对ATP的亲和性提高近100倍，酶活力提高25倍； T4-溶菌酶分子中第3位的异亮氨酸