第五章 非水酶学PPT.ppt

第五章 非水酶学;为什么? 非水介质中酶活性保持与失活的原因 主要研究方法 有机溶剂中酶学性质 水的作用 有机溶剂的作用 有机溶剂中酶催化活性和选择性的调控 ;第一节 非水介质中酶学基础;在一定的条件下,酶在非水介质中可以保持活性,而且其稳定性可能更好,并且可以获得在水介质中所不具备的一些对生产极其有利的性质:如底物特异性(为什么?);酶在有机溶剂中结构变化与活性的关系(活性保持与失活的原因) 酶在有机溶剂中能表现催化活性的原因：酶在有机溶剂中蛋白质能够保持三维结构和活性中心的完整；酶在有机溶剂中维持其天然构象并非一定要固定化； 并非所有的酶悬浮于任何有机溶剂中都能维持其天然构象，保持酶活力；可能与溶剂的介电常数及含水量有关；;研究酶在有机溶剂中结构变化的主要方法包括：EPR、NMR和FT-IR;;(二) 有机溶剂中酶学性质 热力学稳定： 有机溶剂中酶的热稳定性和储存性都比水溶液中高。原因可能是由于有机溶剂中缺少使酶失活的水分子,由水引起的酶分子中天冬酰胺脱氨基作用,天冬氨酸肽键水解,二硫键破坏,半胱氨酸氧化及脯氨酸和甘氨酸的异构化等蛋白质热失活过程全都难以进行.;底物特异性变化及其原因: 酶在有机溶剂中对底物的化学结构和立体结构均有严格的选择性;酶与底物的结合受溶剂的影响,底物专一性在有机溶剂中将发生改变. 在水中酶和底物主要靠疏水作用,而在非水介质中疏水作用已不重要.主要决定于自由能的变化.;对映体选择性: 一般情况下,酶的立体选择性随介质疏水性的增加而降低.;位置选择性: 有机溶剂中的酶催化具有位置选择性,即酶能够选择性地催化底物中某个区域的基团发生反应.;化学键选择性: 非水介质中酶的催化反应具有一定的化学键选择性,即在某种有机溶剂中酶对某种化学基团或化学键的反应性特别强,这种选择性与传统的水介质中的情况可能完全相反.;pH记忆与pH忘记: 有机溶剂中的酶能够记忆它冷冻干燥或丙酮沉淀前所在缓冲液中的pH,这种现象被称为酶的pH记忆. 微水有机溶剂中疏水性的酸或碱与它们的盐组成的混合物,可以作为有机相缓冲液,这两种形式的比例控制着有机相中酶的解离状态,使酶完全忘记干燥前它所处的水溶液的pH值,这种现象叫pH忘记.;非水介质中水的作用;当酶周围的水化层受到破坏时,酶基本上是没有活力的,随着水化程度的增加,酶活力将得到恢复. 酶需要水维持其活性三维结构,水影响蛋白质结构的完整性,活性位点的极性和稳定性;酶周围水的存在,能降低酶分子的极性氨基酸的相互作用,防止产生不正确的构象. 含水量太高时,酶结构的柔性过大,酶的构象将向疏水环境热力学稳定状态变化,引起酶结构的改变和失活.;最适水量和水活度:;水活度对酶活力的影响:;水对蛋白质流动性的影响:;酶活力与蛋白质流动性之间的关系:;有机溶剂;对酶结合水的影响； 这种影响与有机溶剂介电常数(ε)和疏水性参数(lgP)有关. ε越大,lgP越小,对酶结合水的争夺能力越强,酶越容易失水. 增加酶表面的亲水性可以抑制酶在有机溶剂中的脱水作用.;对酶的影响； 动态影响：溶剂介电常数明显影响酶分子活动中心区域的活动性，但酶活性中心的活动性与酶活性并没有必然的联系； 酶结构：虽然酶整体结构和活性中心结构保持完整，但酶分子表面结构和动态结构却发生了变化，一些侧链也发生了显著的重排。 活性中心：主要是通过减少整个活性中心的数量，活性中心丧失的数量取决于有机溶剂的极性，非极性溶剂的影响更明显 活性与溶剂属性：酶活性与溶剂属性之间可能存在某种定量关系，研究最多的是活力与极性参数lgP的关系，当lgP2时，极性强，容易夺取酶分子表面水层，酶活力低故不宜作酶催化反应的非水介质；2lgP4溶剂中可以表现出中等活力；lgP4的溶剂酶具有较高的活力，比较理想。;溶剂对酶底物和产物的影响：使底物和产物溶剂化从而影响酶的活性。;四、有机溶剂中酶催化活性和选择性的调控;水的调控： 调节最适水量； 利用仿水溶剂； 溶剂工程；;利用印迹酶技术制备构象发生有利于酶在非水系统中活性稳定的修饰酶： 什么叫印迹酶：;化学修饰：双亲分子共价或非共价地修饰酶分子表面，可以增加酶表面的疏水性，使酶均一地溶于有机溶剂中，提高酶的催化效率和稳定性。;固定化酶：酶固定化增大了酶与底物接触的表面积，在一定程度上可以提高酶在有机溶剂中的扩散效果和热力学稳定性，调节和控制酶的活性与选择性，有利于酶的回收和连续化生产。;蛋白质工程和抗体酶技术： 温度：适当提高有机溶剂中的反应温度有利于催化反应的进行，但温度同时会影响酶的活性和专一性。;pH和离子强度：在酶参加反应前的预处理的反应过程中采取某种措施，如选择适当的种类和适宜pH缓冲液处理酶，使之不受冷冻过程破坏。 反相胶束中酶活力的控制：;五、动力学;表观米氏常数和单独速度常数: 水和有机溶剂对于酶活