第八章 核酶和抗体酶PPT.pptVIP

过渡态理论认为，酶与底物的结合经历了一个易于形成产物的过渡态，实际上是降低了反应所需的活化能。 1946年，Pauling用过渡态理论阐明酶催化的实质 ---过渡态理论 酶之所以具有催化活力是因为它能特异性结合并稳定化学反应的过渡态(底物激态)，从而降低反应能级。 酶是生物催化剂 在酶催化的反应中，与酶的活性中心形成复合物的实际上是底物形成的过渡状态， 酶与过渡状态的亲和力要大于酶与底物或产物的亲和力。 与反应过渡状态结合作用 W.P.Jencks(1969)认为：酶分子与其催化反应的过渡态在结构和电荷两方面呈互补，即酶分子充当了反应物的模板，使底物分子转变成新的构型；如果抗体能够结合过度态，那么在理论上便能获得催化活性。 这一理论的意义在于，如果使抗原最大限度地接近某一特定反应的过渡态，就可能使诱导的抗体在与之结合时发挥催化作用。 用过渡态类似物诱导的抗体所催化的反应并非该类似物本身，而是与其相似的另一种反应。 抗体酶的发现 Lerner(1984)提出：若以过渡态类似物为半抗原，则其诱发产生的抗体应该与该类似物具有互补构象；这种抗体与底物结合后，就能够诱导底物进入过渡态结构，从而引起催化作用。 根据这个猜想Lerner和苏尔滋(P．C．Schultz)分别领导各自的研究小组独立地证明了：针对羧酸酯水解的过渡态类似物产生的抗体，能催化相应的羧酸酯和碳酸酯的水解反应。 1986年美国《Science》杂志同时发表了他们的发现，并将这类具催化能力的免疫球蛋白称为抗体酶或催化抗体。标志着抗体酶的研究进入了一个新阶段。 1986年Schultz以对硝基苯酚磷酸胆碱酯（PNPPC）作为相应的羧酸二酯的过渡态类似物。 诱导产生的抗体酶使水解反应速度加快12000倍。 1.一种对酶促反应过渡态特异的抗体 ①结合了酶与抗体的优点，既可以起酶促催化作用，又可以起抗体的选择性和专一性结合抗原的作用。 ②抗体酶还具有与天然酶相近的米氏方程动力学及pH依赖性等。 抗体酶具有典型的酶反应特性 2.能催化一些天然酶不能催化的反应 ①具有高效催化性，一般抗体酶催化反应速度比非催化反应快102～106倍，有的反应速度已接近于天然酶促反应速度； ②有许多化学反应还没有已知酶催化进行 ③抗体的多样性决定了抗体酶催化反应类型多样性 ④抗体酶可以根据需要人工裁制 3.有更强的专一性和稳定性 ①与配体(底物)结合的专一性，包括立体专一性，抗体酶催化反应的专一性可以达到甚至超过天然酶的专一性； ②抗体的精细识别使其能结合几乎任何天然的或合成的分子 ③抗体酶催化反应的介质效应 酯解反应中介质效应 ： 抗体酶在有机溶剂中具有稳定性。 脱羧反应中介质效应：有机溶剂引起脱羧反应速率增加。 酰基转移反应中介质效应 ：在疏水溶剂中，活性较高。 抗体酶的催化反应类型 1、转酰基反应 2、水解反应 3、Claisen重排反应 4、酰胺合成反应 5 Diels-Alder反应 6、转酯反应 7、光诱导反应 8、氧化还原反应 9、脱羧反应 10、顺反异构化反应 抗体酶的制备 将抗体转变为酶可通过诱导法、拷贝法、引入法、化学修饰法等途径。 诱导法是利用反应过渡态类似物为半抗原制作单克隆抗体，筛选出具高催化活性的单抗即抗体酶。 拷贝法主要根据抗体生成过程中抗原-抗体互补性来设计的。 引入法则借助基因工程和蛋白质工程将催化基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，使其获得催化功能。 化学修饰法对抗体进行化学修饰，使抗体与催化基团相连。 诱导法 设计半抗原 选择合适的反应过渡态类似物作为化学模型物 用设计好的半抗原，与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原；将此抗原进行免疫——使宿主针对抗原产生抗体。 产生抗体的脾脏细胞 与骨髓瘤细胞相融合，得到的杂交瘤细胞既能产生抗体又能在体外培养； 将杂交瘤细胞克隆化，即能产生单一均匀的抗体。 病毒介导的细胞融 PEG介导细胞融合 电激融合 抗原免疫的脾细胞 （B细胞） 1. 抗体分泌（Ig+) 2.HGPRT+在HAT生长 小鼠骨髓瘤细胞 （B细胞恶性肿瘤） 1.具永生性 2.筛选出HGPRT-株 PEG 融合 HAT筛选 脾-骨髓瘤细胞 （杂交瘤细胞） （HGPRT+、Ig+） 一般情况下，用于杂交瘤细胞检出的培养基采用HAT培养基，即在正常的培养基中添加了次黄嘌呤（H）氨基蝶呤（A）(叶酸拮抗剂)和胸腺嘧啶T）。 HAT培养基筛选 H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶 DNA 内源性途径(主要途径) 谷氨酰胺 or 单磷酸尿苷酸 二氢叶酸还原酶 A H T 外源性途径(旁路途径) (Hypoxanthi