第十二章 动物细胞与组织培养技术PPT.pptVIP

第十二章 动物细胞与组织培养技术 目的：1、掌握动物细胞体外扩大培养的方法；2、了解应用生物反应器大规模培养动物细胞的相关知识；3、掌握细胞冷冻保存的相关技术。 重点：生物反应器大规模培养细胞的有关知识 7、动物细胞大规模培养技术 利用大规模培养哺乳类细胞是一项重要的生产生物制品的技术，包括疫苗、干扰素、激素、生长因子和单抗等，具有很高的经济和社会效益，常用的方法有气升式深层培养系统、微载体培养系统、微囊培养系统、大载体培养系统和中空纤维培养系统。 气升式深层培养系统 全自动气升式深层培养系统为全部密闭结构。混合气体自培养器底部管道输入，气体沿着培养器中央的内管上升，一部分气体，从培养器的顶部溢出，另一部分气体被引导沿培养器的内缘下降，直达培养器底部和新吹入的气体混合而再度上升，这样借助气体的上下，不断循环，搅动培养器内的细胞，通过微机程序控制混合气体的组分，维持培养液内一定的溶氧和pH值。 气升式反应器的基本原理如图所示。气体混合物从底部的喷射管进入反应器的中央导流管使得中央导流管侧的液体密度低于外部区域从而形成循环。气升式生物反应器主要采用内循环式，但也有采用外循环式。 图3-4-8—1 气升式反应器的基本原理 气升式生物反应器产生的湍流温和而均匀，剪切力相当小，反应器内没有机械运动部件，因而细胞损伤率比较低；同时由于采用直接喷射空气供氧，氧传递速率高；液体循环量大，能使细胞和营养成分均匀地分布于培养基中。 优点 气升式反应器和传统培养方法的抗体产率比较 细胞系 抗体类型 抗体产量，mm/l 气升式/传统 培养瓶 滚瓶 气升式 1 IgG 14 20 86 5.1 2 IgM 70 127 295 3.0 3 IgG 9 10 73 7.7 4 IgG 28 30 100 3.4 5 IgG 60 76 260 3.8 6 IgM 20 25 112 5.0 7 IgG 30 38 200 5.9 8 IgG 120 100 350 3.2 微载体培养系统 原理：利用固体小颗粒作为载体，细胞附着之，通过连续搅拌悬浮于培养液中。由于扩大了细胞的附着面，提高了细胞的生长效率和产量。微载体是由天然葡萄糖聚合物（葡聚糖）或者各种合成的聚合物组成的。目前商品化的有CytodexⅠⅡⅢ，biocarrier，gelibead，和DEAE－cellose等。 微载体及性质 一种理想的细胞支持物应该具备的特征： ①良好的物理性能：颗粒大小均一，比表面积大；传质性与机械稳定性好； ②良好的化学性能：对细胞无毒害；相容性好； ③对细胞生长有利：利于贴壁；能固定大部分细胞；保护细胞免受机械损伤；适合于贴壁细胞和悬浮细胞培养； ④方便使用：能高压灭菌；易于清洗；可重复使用；接种方便；分离方便；适合大规模培养； 微载体培养系统培养细胞的具体步骤： ①选择合适的载体类型 ②浸泡水化及消毒 ③接种 ④培养观察与细胞计数 ⑤消化 ⑥分离细胞 ⑦传代培养 多孔载体培养 为克服实心微载体培养细胞的不足，而近几年开发研制的新型细胞培养支持物。具有提高细胞固定化、降低血清用量、提高搅拌强度和通气量以及强化传质等优点。可应用于大规模高密度培养系统。 可用于多孔载体制备的材料多种多样，纤维素与玻璃更受青睐。其制作的主要步骤为：分散成球材料→成球材料固化→去除临时性成孔物质→后期处理（表面处理、清洗、灭菌）。 微囊培养系统 其原理是将细胞悬浮于海藻酸钠溶液中，当溶液通过一个可形成小滴的装置，滴入氯化钙溶液，能形成凝聚小球。小球先后用聚-L-赖氨酸和聚乙烯胺溶液洗时，表面可形成一层半透膜。细胞可在半透膜内生存，代谢过程中的废物可通过半透膜不断排出，而分泌的抗体则积累在半透膜形成的囊内。小球离心破碎后，可得到大量纯度很高的单克隆抗体。微囊法主要适用于生产单克隆抗体、干扰素等产品。 ★胰岛细胞的微囊化培养 微囊化培养的大鼠兰氏胰岛细胞植入患糖尿病的大鼠体内，起到人工胰岛的作用，对患病鼠具有一定的疗效。将分离的胰岛细胞培养1-3天后，按1.75×103cells/ml浓度悬在1.5%海藻酸钠溶液中制成微囊，按4×103个微囊/只老鼠，腹腔植入培养一段时间后，血糖由350±29mg/dl下降至142±12mg/dl，并保持了一年。 流化床生物反应器 流化床生物反应器的基本原理类似于流态床化学反应器，不同的是，流态化的固体是带有细胞的微粒。培养液通过反应器垂直向上循环流动不断提供给细胞必要的营养成分，使细胞得以在微粒中生长；同时，不断地加入新鲜的培养液，并不断地排除培养产物或代谢产物。 气体交换 氧气 回流 收