第十章 PCR技术PPT.ppt

第十章 核酸扩增技术;;DNA样品;1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆基因。 但由于测序和引物合成的困难，Khorana的设想被人们遗忘了…… ;DNA变性、复性（退火）;DNA半保留复制;体内DNA的生物合成;很少有在公司工作的科研人员获得诺贝尔，Mullis是其中之一;Mullis开车的时候，瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA，……;Mullis的方法;引物;94℃;Taq DNA聚合酶（Thermus aquaticus);72℃; 一种能在体外特异地扩增特定核酸片段的技术，可以在几个小时内将极微量的目的基因扩增成千上万倍。 ;1、变性：加热使双螺旋的模板DNA分开，形成单链DNA 。 2、退火：降低温度，引物和DNA模板的互补区域形成局部杂交。 3、延伸：在模板链的指导下，DNA聚合酶将4种脱氧核苷酸（dNTP）沿5’→3’方向加到引物上，形成新的DNA链。 4、以上三个步骤的循环。;;;;;;;第3轮 变性、退火;PCR理论扩增效率;PCR的特点;DNA聚合酶（Taq酶） 引物 原料（dNTP） 模板（DNA分子) Buffer（Mg2+）缓冲液（酶促剂）;（1）Taq DNA聚合酶（Thermus aquaticus) 价格适宜，延伸速度1kb/min， 无校正功能；具有类似末端转移酶的活性，末端加A； 使用浓度：1-2.5 U/50 ?l（酶量过多，反应特异性下降；酶量过少影响反应产量）。 （2）Pfu DNA聚合酶（高保真酶） 有很强的校正功能，延伸速度500bp/min，价格昂贵。 （3）ExTaq 普通rTaq和Pfu DNA聚合酶的混合物 ;引物设计：引物是PCR特异性反应的关键 （1）引物长度：20-30 bp为宜。 （2）引物组成：G+C占40-60%；引物对碱基组成一致。 （3）引物结构：碱基尽可能随机分布；内部、两引物间避免有互补序列；引物3’端为关键，必需与模板碱基配对（最好是G/C）；5’端无严格限制，可以修饰。 （4)引物特异性：与目的基因特异配对，与非扩增区无同源性。;;;原料（dNTP）;模板;Tris-HCl（pH8.3~8.8）——调节pH KCl或(NH4)2SO4——促进引物退火 小牛血清白蛋白或明胶——稳定酶活性 甲酰胺——促进引物与模板配对， 特异产物增加，灵敏度增加; 可影响酶活性、解链??度、退火温度、扩增效率、扩增特异性和引物二聚体的形成等。 Taq酶活性需要Mg2+ ，Mg2+浓度过高导致非特异扩增。在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200?mol/L时，Mg2+浓度为1.0～2.5mmol/L为宜。 注意：PCR体系中的dNTP、引物和模板的磷酸基都可以和Mg2+结合，从而降低游离Mg2+的浓度。;反应条件： 预变性：94-98℃；破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构 变性温度和时间：94-98℃/30~60s； 退火温度和时间：50-65℃/30~60s； 原则：比引物Tm低3~5℃，或计算： 退火温度(℃)＝4(G+C)＋2(A+T)－(5～10) 延伸温度和时间：70-75℃（72 ℃ ）/1min(1kb)； 循环次数：一般为25-35次（次数过多，扩增效率降低，错误率增加） 扩增后延伸：72℃，4~10min，确保充分延伸。;模 板：反转录产物 2 ?l 底 物：dNTP（each 0.5mM） 2 ?l 引 物：上、下游引物（5?M） 各1 ?l 复制酶：Taq DNA聚合酶（5U/?l ） 0.2 ?l 缓冲液：10×buffer（含Mg2+) 2 ?l 灭菌ddH2O 11.8 ?l （20 ?l体系），混匀;是否为特异性扩增？ 依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。 ;凝胶电泳分析　 凝胶电泳可以帮助判断扩增产物的大小及产量 2. 酶切分析　 既能进行产物鉴定，又能进行基因分型，还能进行变异性研究 3. 分子杂交分析　 分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR产物碱基突变的有效方法 4. 测序分析　 DNA测序是检测PCR产物特异性的最可靠方法，不仅能进行基因分型，还能进行变异性研究;PCR中