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基因工程实验 实验讲义 水产与生命学院 2010 年 12 月 目录  基因工程实验注意事项 2  实验一 总RNA 的提取 3  实验二cDNA 第一条链的合成 4  实验三 重组 DNA 的制备（设计性实验） 5  实验四 碱变性法提取质粒 DNA （小规模） 8  实验五 提取中华绒螯蟹肌肉中基因组 DNA 10  实验六 利用RACE 法克隆基因（设计性实验） 11  1 基因工程实验注意事项 1. 上实验课不能迟到，分小组进行实验。 2. 课前要提前预习实验内容，弄清实验设计的原理，理清实验顺序。 3. 由于实验内容多，时间短，多数实验需要同时或穿插进行，做好 统筹安排。 4. 实验的每一步都要详细的记录操作内容、时间、步骤、结果等。 5. 对任何自己不熟悉的实验仪器（尤其是移液器）都不要随意操作。 在操作过程中发现任何意外的现象都要及时向任课老师汇报。 6. 在实验室内不能大声喧哗，，严格遵守课堂纪律。 7. 在实验操作过程中注意一定要穿实验服，带手套，制造的任何垃 圾都要丢到垃圾筐里，严禁随地投弃。特别注意对废弃细菌的杀 灭和有毒垃圾的定点投放。 8. 实验时损坏的任何物品都要及时申报。 9. 实验结束后要把用过的器皿清洗干净并归放整齐、清点数目，向 老师汇报征得同意后方可离开实验室。 10.写作实验报告或实验论文一定要纹理通顺、逻辑清晰、图标说明 详细、讨论分析透彻（包括操作的失误）。 2 实验一 总 RNA 的提取 【实验目的】 1. 掌握一种 RNA 提取的方法。 【实验原理】 TRIZOL 试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白 体的解离，使 RNA 与蛋白质分离，并将 RNA 释放到溶液中，当加入氯仿时，它可抽提酸性的 苯酚，而酸性苯酚可促使 RNA 进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样 RNA 与仍留在 有机相中的蛋白质和 DNA 分离开。水相层（无色）主要为 RNA，有机相主要为 DNA 和蛋白质。 【实验药品与器材】 匀浆器，微量移液器，微量恒温器，1.5mL 离心管，冷冻离心机，Trizol 试剂，氯仿，异丙 醇，75％酒精，DEPC 水，琼脂糖，电泳仪，分光光度计。 【步骤】 取样：将罗氏沼虾活体解剖，迅速取卵巢组织约 100mg 于1.5ml 的离心管中，置液氮罐冷冻 备用。用 Trizol 试剂提取总 RNA： 1. 每个离心管加 1mL Trizol 试剂于冰上碾碎组织 2. 碾碎后在 30℃恒温箱中保存 5 分钟 3. 每 1mL Trizol 加 0.2mL 氯仿，用手震荡 15 秒，放 30℃恒温箱中 3 分钟 4. 离心：低温 4 ℃，12000g，15 分钟 5. 取上层水相到另一干净离心管 6. 每 1mL Trizol 加 0.5mL 异丙醇，30℃恒温箱中 10 分钟 7. 离心：低温 4 ℃，12000g，10 分钟 8. 清洗 RNA ：移去上清，每 1mL TRIzol 加入 1mL 75%酒精，用移液枪反复吹洗打散 9. 离心：低温 4 ℃，7500g，5 分钟 10. 乙醇析出，可见白色沉淀于管壁，自然干燥 15 分钟 L DEPC 直至完全溶解，然后放置于-80℃冰箱保存。 11. 用 30 μ 12. 1%琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 质量 13. 测 OD 值 3