第九章 动物细胞培养技术PPT课件.pptVIP

多孔载体材料要求：生物相容性、机械稳定性、热稳定性 6、微囊化培养技术 人造半透膜（多聚赖氨酸等）制成的多孔微球体，通过固定化技术将细胞包裹在微囊内， 在培养液中悬浮培养。 小分子物质可以自由透过，而各种酶、辅酶、离子交换剂、活性炭及蛋白等大分子物质包裹其中，促进细胞生长增殖。 优点： 1、具有半透性膜特性； 2、细胞密度大108/ml； 3、产物在单位体积中浓度高、分离纯化简单。 微囊直径控制在200-400μm为宜，使营养物和代谢物自由通过； 温和、快速、不损伤细胞，尽量在液体和生理条件下操作； 所用试剂和膜材料对细胞无毒害； 膜应有足够机械强度抵抗培养中搅拌。 培养系统可采用搅拌式或气升式反应器系统，适用于单克隆抗体、干扰素的制备。 应用： 生产：采用分批式和连续灌注式培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体，在7～27 d微囊内抗体浓度可达1250～5300 mg/ L 。 免疫移植：利用微囊包裹具有特定功能的组织细胞，形成免疫隔离的人工细胞，植入疾病动物或患者体内。微囊化胰岛移植治疗大量实验性糖尿病。他们将同种大鼠胰岛用海藻酸- 聚赖氨酸- 聚乙烯亚胺包埋后植入链脲霉素诱导的糖尿病大鼠体内，在未用免疫抑制剂的情况下，控制大鼠血糖正常达一年左右。 微囊化神经细胞 原代培养与检查 接种、培养 ↓ 常规检查 （检查细胞形态及活力、检查营养液pH及污染） 2、传代培养技术 传代：当原代培养成功后，细胞分裂增殖成片时，需要对其分离重新培养。 第一次传代时间：有80-90%或刚刚全部汇合的细胞是传代的理想时期。过早产量不足，过晚细胞状态不佳。 基本步骤： 吸出培养瓶内旧培养液 ↓ 加入胰蛋白酶和EDTA混和液 (以能覆盖整个瓶底为准） ↓ 吸出消化液，加入培养液终止消化 ↓ 吸管轻轻吹打使细胞分散成悬液，计数 ↓ 重新接种于新的培养瓶内 1）贴壁生长细胞传代 ↓ 培养 2）悬浮生长细胞传代 离心法传代 直接传代法 离心法传代：离心（1000转/分-800g）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1／2--2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 （四）细胞的冻存复苏 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作 1、冻存意义 1）长期保存细胞； 2）防止细胞老化； 3）减少人力、经费，减少污染。 2、冻存和复苏的原则：慢冻快融 细胞冷到零度以下，产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，在细胞内形成冰晶； 细胞冻存时要尽可能均匀地减少细胞内水分，减少胞内冰晶形成是减少细胞损伤的关键； 缓慢冷冻，使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶重结晶。 3、保存细胞三要素：营养、保护剂和低温 低温保护剂的应用 在细胞冻存时加入保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是甘油或DMSO，渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。 保护剂的浓度在5~15%之间，常用10%。 4、慢冻程序 标准程序： 当温度在-25 ℃以上时， 1～2 ℃/min 当温度达-25 ℃以下时， 5～10 ℃/min 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中。 简易程序： 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2 ℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。 常用细胞冻存方法 1 预先配制冻存液：20%血清培养基与DMSO-- 9 :1； 2 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/ml)； 3 分装：每瓶1ml，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期； 4、冻存 1)传统方法：冷存管置于4℃10分钟→ -20℃30分钟→ -80℃16～18小时(或隔夜)→液氮槽长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，存活率稍微降低一些。 (2)程序降温：利用已设定程