PCR质控和问题分析.ppt

PCR质量控制及常见问题分析、对策 临床检验技术历经了 一、化学试剂检验 二、酶促生化检验 三、抗原-抗体免疫反应等三个主要技术阶段 四、近年来人类基因组计划的完成也推动了临床检验进入基因检测-分子诊断时代 血糖 检测 一? PCR技术最根本特征 二? PCR系统外的质量控制 三? PCR体系内的常见问题、原因分析及对策 1.传统诊断: 靶A+试剂B 信号C, 均为信号相加模式。 2.PCR: 1,2,4,8------230(109)--- 2n -----靶分子指数增加模式。 PCR极高扩增放大倍数亦带来非特异性过度放大! 1. 硬件建设: 2. 软件控制: 标准操作SOP, 人员操作培训,质量追踪体系。 分室/分区实验室, 安全柜,仪器,螺盖管/胶膜96孔板, PCR反应液加矿物油封闭,UDG酶消除气雾胶。 PCR体系问题、原因分析及其解决方案 提高PCR反应特异性的策略 临床PCR检测的常见问题 实时荧光PCR定量检测的关键问题 PCR体系内的常见问题、原因分析及其对策 PCR标准反应体系 DNA模板 引物 反应缓冲液 Mg 2＋浓度 dNTPs dH2O 耐热聚合酶 反应体系对PCR扩增的影响 DNA模板 纯 度 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应 完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物 浓 度 加量过多导致非特异性扩增增加 引 物 特异性 长度适当、避免二级结构和二聚体PD 完整性 避免反复冻融 浓 度 应适当,过高导致非特异性增加, 过低则扩增产物 太少 反应体系对PCR扩增的影响 过高非特异性严重 过低无扩增产物 浓度适当 避免反复冻融 pH值适当 避免污染 pH值,盐离子浓度 稳定剂,增强剂 反应缓冲液 dNTPs dH2O Mg 2＋浓度 如何选择最合适的DNA聚合酶 PCR用耐热DNA聚合酶 Taq酶 pfu酶 Hotstart Taq酶 混合酶 Taq plus Long Taq Taq platinum 特异性-----基因组扩增、RT-PCR 保真性-----基因筛选、测序、克隆 长片段扩增-----构建基因图谱、测序等 扩增效率-----复杂模板扩增（GC含量高、二级结构） PCR试剂盒-----复杂模板扩增、大规模基因检测 如何选择最合适的DNA聚合酶 -----根据PCR实验需求 PCR常见问题之一-----无扩增产物 现象：正对照有条带，而样品则无 M 1 2 正对照 原 因 模板含有抑制物，含量低 引物设计不当或者发生降解 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 降低退火温度、延长延伸时间 对策 PCR常见问题之二-----非特异性扩增 现象： PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。 原 因 对策 引物特异性差 模板或引物浓度过高 退火温度偏低 循环次数过多 重新设计引物或者使用巢式PCR 适当降低模板或引物浓度 适当提高退火温度或使用二阶段温度法 减少循环次数 PCR常见问题之三-----拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态 M 1 2 原 因 对策 模板不纯 退火温度偏低 循环次数过多 纯化模板 适当提高退火温度 减少循环次数 PCR常见问题之四-----假阳性 现象：空白对照出现目的扩增产物 原 因 靶序列或扩增产物的交叉污染 对策 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。 提高PCR反应特异性策略 巢式PCR（Nest-PCR） 递减PCR（TouchDown PCR） 热启动PCR（HotStart PCR） 使用PCR增强剂 策略之一巢式PCR PF1 PR1 PF2 PR2 巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。 巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5' RACE）的特异性。 策略之二递减PCR 递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃,直到退火温