蛋白质组学及分析技术课第九讲.ppt

蛋白质组学与分析技术（第 九 讲） 酵母双杂交技术 主要内容 酵母双杂交概念 酵母双杂交的基本原理 酵母双杂交系统的优缺点 酵母双杂交系统的应用 酵母双杂交衍生系统 酵母双杂交技术未来展望 什么是酵母双杂交？ 酵母双杂交(Yeast Two-Hybrid)，简称双杂交系统(Two-Hybrid System)，又称相互作用陷阱(InteractionTrap)，是1989年由Stanley Fields和Song等在验证两个蛋白质间相互作用的亲和力时初步建立的，并在Nature杂志上首先描述了这一系统，该系统是以酿酒酵（S.cerevisiae）为宿主，在酵母菌内研究蛋白质－蛋白质相互作用的一种分子生物学方法。酵母双杂交正成为探索蛋白质相互作用最常用和最有力的工具。 目前已被广泛地应用于真核基因的表达与调控、细胞黏合因子间的相互作用、信号传导通路以及细胞周期与分化、反式因子的鉴定与分离等诸多领域的基础研究及药物开发。 酵母双杂交的基本原理 酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物转录起始调控的认识。转录起始需要转录激活因子的参与，而真核生物转录激活因子大多是由结构上分离、功能上独立的两个结构域组成，即DNA结合结构域(DNA binding domain,简称为DNA-BD)和转录激活结构域(transcription activating domain,简称AD)。转录激活蛋白可以和DNA上特异的序列结合，同时可启动相应因子的转录。 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DNA-BD和AD都不能激活转录起始。但不同转录激活因子的DNA-BD和AD形成的融合蛋白仍然具有正常的激活转录起始的功能。 与DNA结合结构域(DNA-BD) 融合的蛋白一般称为“诱饵蛋白”(bait protein) 与转录激活结构域(AD)融合的蛋白一般称为 “猎物蛋白” (prey protein)或“靶蛋白”(target protein) 如果分别融合于DNA-BD和AD上的“诱饵蛋白”和“猎物蛋白”之间存在相互作用, 那么DNA-BD和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应报告基因(reporter gene)的转录与表达。 通过对报道基因表达产物的检测, 反过来就可判别 “诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。 酵母双杂交系统的优缺点 1 酵母是真核细胞，表达的蛋白可保持天然状态在细胞中产生相互作用，一定程度上代表了细胞内的真实情况； 2 易于转化、便于回收扩增质粒， 3 采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料来构建cDNA文库，分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白； 4 具有很多营养缺陷型标记和特征报道基因,筛选方便； 5 高度敏感性，可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时性的相互作用； 6 酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合，避免了对文库编码蛋白的干扰。 1 有些诱饵蛋白质本身具有激活转录功能使在无特异激活结构域情况下激活转录； 2 有些蛋白通常在细胞表面发生相互作用，不能稳定地在酵母中表达或定位于酵母细胞内； 3 有些DNA-BD融合蛋白或AD融合蛋白一部分可能封闭正常的作用位点，或者破坏了蛋白质的正确折叠，从而影响了蛋白间作用的能力； 4 有些蛋白质的正确折叠、修饰和功能有赖于其它非酵母蛋白的辅助，这限制了某些胞外蛋白（如哺乳动物）和细胞膜受体蛋白等的研究； 5 有些蛋白质本身对酵母细胞具有毒性作用。 酵母双杂交系统的应用 1 检验－对功能已知蛋白间的相互作用 优点快速和高灵敏度，且反映了蛋白在体内的相互作用；还能检测出瞬间发生的信号反应，而用体外检测法检测蛋白要经过一系列洗涤过程，常致使相互作用不再发生。融合蛋白由于BD和DNA序列的相互作用而变得更加稳定。并且杂合蛋白一般都是由高拷贝质粒的强启动子过量表达的蛋白，在转录过程中产生了一些复合酶使信号得以放大。 2 研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域 可应用于确定两已知有生理作用的蛋白间的作用位点或结构域。利用此系统已分析和测定了多种重要的结构域，当证实了两个蛋白有相互作用后，可以对其进行缺失实验而找到相互作用发生所必须的氨基酸残基。通过该方法还能研究蛋白质的结构与功能。通常需要对待测蛋白做点突变或缺失突变的处理。 3发现新的作用蛋白质 用已知功能的蛋白基因筛选双杂交cDNA文库，以研究蛋白质之间相互作用的传递途径，寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白，是双杂交系统最广泛和最有价值的应用。 4 寻找具有药物治疗作用