分子生物学 第二章 核酸的结构和功能.ppt

（一）核酸的变性 变性只涉及次级键的变化，磷酸二酯键的断裂称核酸降解。 变性时发生增色效应。 加热DNA的稀盐溶液，达到一定温度后，260nm的吸光度骤然增加，表明两条链开始分开，吸光度增加约40%后，变化趋于平坦，说明两条链已完全分开。 这表明DNA的热变性是个突变过程，类似结晶体的熔解。 若将核酸水解为核苷酸，紫外吸收值通常增加 30%～40%，这种现象被称作增色效应(heperchromic effect)。这是由于在双螺旋结构中，碱基有规律的紧密堆积降低了其对紫外光的吸收。 将紫外吸收的增加量达最大增量一半时的温度值称熔解温度(melting temperature, Tm)。 双链RNA比双链DNA稳定，同样序列的双链RNA比双链DNA的Tm高大约20℃。 RNA-DNA杂合双链的Tm介于双链RNA和双链DNA之间。 影响Tm的因素 (1) DNA 的均一性越高，Tm的温度范围越小。 (2) G-C含量越高， Tm的值越大，若GC的含量上升1%，则Tm上升0.41℃。马默多蒂（Marmur-Doty）关系式： Tm = 69.3 + 0.41(G + C)%， 或GC% =（Tm - 69.3）× 2.44 (3) 介质的离子强度较高时， Tm的值较大。 (4) 酸性条件下，核酸容易脱嘌呤，碱性条件下，核酸容易变性，通常加NaOH 降低Tm的值。 (5) 尿素、甲酰胺等化学试剂可以降低Tm的值，称作变性剂。 Heat denaturation of DNA from various sources, so-called melting curves. The midpoint of the melting curve is defined as the melting temperature, Tm. （二） 核酸的复性 变性核酸的互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋的过程称复性(renaturation)。 变性核酸复性时需缓慢冷却，故又称退火(annealing)。 复性后，核酸的紫外吸收降低，这种现象被称作减色效应(hepochromic effect)。 此外，核酸溶液的其它性质也恢复为变性前的状态。 Steps in the thermal denaturation and renaturation of DNA. The nucleation phase of the reaction is a second-order process depending on sequence alignment of the two strands. This process takes place slowly because it takes time for complementary sequences to encounter one another in solution and then align themselves in register. Once the sequences are aligned, the strands zipper up quickly. 影响复性速度的因素 (1) 复性的温度 复性时单链以较高的速度随机碰撞，才能形成碱基配对。 若只形成局部碱基配对，在较高的温度下，两条链会重新分离，经过多次试探性碰撞，才能形成正确的互补区。 所以，核酸复性时温度不宜过低，Tm – 25℃是较合适的复性温度。 (2) 单链片段的浓度 单链片段浓度越高，随机碰撞的频率越高，复性速度越快。 复性是典型的二级反应，符合二级反应的动力学方程，用t表示复性的时间，C表示时间为t时，单链片段的浓度，k为速度常数，则其反应的速度方程式为： 以C0表示时间为t0时单链片段的浓度，C表示时间为t时，保留的单链片段的浓度，对上式进行积分可得： 当 时，t为t1/2，则： 可得： 可见，C0t1/2为速度常数k的倒数，C0t1/2越大，复性速度越慢。 (3) 单链片段的长度 单链片段越大，扩散速度越慢，链间错配的概率也越高，因而复性速度也越慢。 (