植物组织培养实验指导(修改).docVIP

植物组织培养实验指导 实验项目、内容提要及实验安排一览表 序号 实验名称 内容提要 实验要求 集中实验时数 实验类型 每组人数 1 实验用具的洗涤和灭菌 培常用用具（如玻璃器皿、剪刀、镊子等）的洗涤技术和灭菌方法及注意事项 必开 验证 2 2 培养基（MS）母液的配制 配制培养基（MS）的各种母液 必开 综合 2 3 培养基（MS）的配制及灭菌 培养基的必开 综合 2 接种用具及培养基的灭菌 4 植物外植体消毒和接种 材料的灭菌必开 综合 2 接种 5 愈伤组织的诱导 培养必开 综合 2 4 6 愈伤组织的继代培养基的灭菌继代培养必开 综合 观察、统计及拍照记录 4 7 愈伤组织的（植株再生） 培养基的灭菌培养必开 综合 观察、统计及拍照记录 4 实验一 实验用具的洗涤和灭菌 【目的】 使学生了解植物组织培养中常用的洗涤技术和灭菌方法；掌握培常用用具（如玻璃器皿、剪刀、镊子等）的洗涤技术和灭菌方法及注意事项，为后续实验做准备。【实验用具】 高压蒸气灭菌锅、实验所需的各种玻璃器皿、金属用品及塑料用品。 【实验方法】 1．洗涤技术 1.1 洗涤液 铬酸洗涤液是用重铬酸钾(K2Cr2O7)与硫酸(H2SO4)配制而成，可根据需要配制成弱、中、强三种。 弱：用重铬酸钾40g加入蒸馏水1L，加热溶化，冷却后再缓慢加入浓硫酸90ml。 中：用重铬酸钾40g加入蒸馏水100ml，加热溶化，冷却后再缓慢加入浓硫酸875ml。 强：与浓硫酸加热的同时缓慢加入磨碎的重铬酸钾，直到重铬酸钾达到饱和为止。一般浓硫酸1L加入重铬酸钾40g。 1. 2 洗涤方法 (1) 玻璃器皿洗涤 新的玻璃器皿上附有游离的碱性物质，其洗涤方法是用1%的HCl溶液浸泡一昼夜，再用合成洗涤剂洗刷，然后用清水反复冲洗，最后用蒸馏水冲洗1～2次，干燥后即可使用。已使用过的试管、烧杯、三角瓶等的洗涤方法是，先将器皿中的残渣除去，用清水洗净，再用合成洗涤剂洗刷，用清水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗1～2次。用过的吸管、滴管等内径狭小的玻璃制品，需先放入铬酸洗涤液中浸泡两小时以上，取出后经流水冲洗半小时左右，再用蒸馏水冲洗1～2次，然后烘干或晾干。载玻片和盖玻片容易破碎，洗涤时不宜用力擦洗，其洗涤方法是先用清水冲洗，然后放入铬酸洗涤液中浸泡几小时或用稀铬酸洗涤液煮沸半小时，取出后用清水冲洗干净，将其储藏在95%的酒精中。 (2) 塑料用品洗涤 塑料用品一般用合成洗涤剂洗涤，因其附着力较强，因此冲洗时必须反复多次，最后用蒸馏水冲洗。 (3) 金属用品洗涤 金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤，需要清洗时，一般用酒精擦洗，并保持干燥。 2灭菌、消毒技术 物理方法：物理灭菌 干热、湿热、射线处理；物理除菌 过滤、离心沉淀等。 化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌 培养基灭菌 分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌条件为温度121℃，压力1.1kg/cm2，灭菌时间与培养基容量的关系见下表。如果使用人工控制的灭菌锅，必须注意灭菌温度的稳定控制，因为温度过高会引起培养基成分和pH的改变，而温度过低则会造成灭菌不彻底。灭菌后的培养基室温下最好在1～2周内用完，特殊情况可贮存于4℃下1个月左右。 培养基体积与灭菌时间的关系 培养基体积（mL） 灭菌温度（℃） 灭菌时间（min.） 20－50 121 20 50－500 121 25 500－5000 125 35 . 2 玻璃器皿灭菌 玻璃器皿可任选湿热和干热灭菌方法灭菌。湿热灭菌条件与培养基灭菌条件一致，但要适当延长灭菌时间，一般以25～30分钟为宜。湿热灭菌后器皿和包装表面常常有水蒸气覆盖，如果不及时干燥常常容易微生物的再侵染，因此，器皿灭菌后应及时放入净化工作台上吹干。干热灭菌即在烘箱中加热至160～180℃后恒温保持40分钟，或120℃灭菌2小时。玻璃器皿放入烘箱之前必须完全干燥，以免引起破碎，灭菌时温度要缓慢上升，灭菌后待温度逐渐下降到60℃以下时才能开箱门，以免器皿因突然冷缩而破碎。. 3 金属用具灭菌 镊子、剪刀、解剖刀、接种针等金属制品，使用前和使用过程中均必须灭菌并保持无菌状态。使用前的灭菌可采用干热灭菌。使用过程中的灭菌通常是将其浸泡在70%的酒精中，再以火焰将酒精烧去，待冷却后使用。也可使用一种小型电热石英砂灭菌器，代替酒精灯，每次使用完后，将用具插入消毒器的中消毒，用时取出冷却。.4 接种室灭菌 接种室污染的主要来源是空气中的细菌和真菌孢子。因此，每次接种前应进行地面的清洁卫生工作，并用70%酒精喷雾使空气中的灰尘沉降，并用紫外线灯照射20min,接种前工作台面要用新洁尔灭或酒精擦洗，使用超净工作台对接种环境污染的控制更有成效。但它应置放在洁净的房