分子生物学——基因工程和基因体外表达.ppt

(三)黏性质粒（cosmid） 是由λ噬菌体的黏性末端（cos区）与质粒重新构建的载体，为双链、环状DNA。其克隆容量可达40～50 kb。 (四) M13噬菌体 (M13 phage) 一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体。 感染细菌后，经过复制转变为双链的复制型（RF）。复制型M13可用作克隆载体。 (五) 病毒载体 逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、EB病毒等作为基因转移的载体。多数病毒载体均已质粒化，病毒载体质粒主要由病毒启动子、包装元件、选择性遗传标记，以及pBR322的复制子组成。 二、表达载体 (一) 原核表达载体 表达载体中含有复制起始位点、抗性基因 、克隆位点 、启动子 、核糖体结合位点和转录终止信号。 multiple cloning site (二) 真核表达载体 含有原核复制起始位点、抗生素抗性基因. 还含有真核表达元件,包括启动子、增强子、克隆位点、 转录终止信号和poly (A) 加尾信号. 第三节 基因克隆的基本过程 ? 基因克隆主要步骤： ① 制备目的基因和选择相关载体 ② 目的基因和有关载体进行连接 ③ 重组的DNA导入受体细胞 ④ DNA重组体的筛选和鉴定 ⑤ DNA重组体的扩增、表达和其他研究 （二）从cDNA文库中获得 （三）PCR扩增特定基因 （四）人工合成 一、? 目的基因的获得 （一）从基因组文库中获得 几种常用克隆载体的比较 注：+表示可用；-表示不可用 比较内容 质 粒 λ噬菌体 黏性质粒 M13噬菌体 克隆容量 10 kb 22 kb 40～50 kb 1 kb 基因组DNA文库 - + + - cDNA文库 + + - - 亚克隆 + - - + 序列分析 + + - + E.coli表达 + + - - 二、载体的选择与准备 三、DNA分子的体外连接 （一）黏性末端 （二）人工接头的使用 （三）加入同聚体尾 （四）平端连接 （一）黏性末端 （二）人工接头 （三）加入同聚体尾 待克隆DNA片段 重组质粒 混合、退火 空白质粒 （四）平端连接 四、外源DNA导入宿主细胞 （一）转化（transformation） （二）感染（infection） （三）转染（transfection） 五、目的基因的筛选和鉴定 外源基因导入宿主细胞后，筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。 所用的方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等。 （一） 遗传学方法 1. 插入灭活法 2. 蓝-白筛选（α互补） 许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基端145个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点。这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们可以互补形成具有活性的β-半乳糖苷酶，使人工底物X-gal转化成蓝色的代谢产物，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源DNA片段，将使lac Z基因灭活，不能生成有活性的β-半乳糖苷酶，结果菌落呈现白色。 （二） 免疫学方法 如果克隆基因的产物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表达，因而可用相应的抗血清或单克隆抗体，通过放射免疫、化学发光或显色反应进行筛选。 菌落原位杂交的原理 （