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第八节 高效液相色谱法 高效液相色谱（High Performance Liquide Chromatography） 高压液相色谱（High Pressure Liquide Chromatography） 高速液相色谱（High Speed Liquide Chromatography） 高分离度液相色谱（High Resolution Liquide Chromatography） 现代液相色谱（Modern Liquide Chromatography） 高效液相色谱法的特点 （1）分离效能高 由于新型高效微粒固定相填料的使用，液相色谱填充柱的柱效可达2×103-5×104块/米理论塔板数，远远高于气相色谱填充柱103块/米理论塔板数的柱效。 （2）选择性高 由于液相色谱柱具有高柱效，并且流动相可以控制和改善分离过程的选择性。因此，高效液相色谱法不仅可以分析不同类型的有机化合物及同分异构体，还可分析在性质上极为相似的旋光异构体，并已在高疗效的合成药物和生化药物的生产控制分析中发挥了重要的作用。 （3）检测灵敏度高 在高效液相色谱法中使用的检测器大多数都具有较高的灵敏度。如被广泛使用的紫外吸收检测器，最小检出量可达10-9g；用于痕量分析的荧光检测器，最小检出量可达10-12g。 （4）分析速度快 由于高压输液泵的使用，相对于经典液相（柱）色谱，其分析时间大大缩短，当输液压力增加时，流动相流速会加快，完成一个样品的分析时间仅需几分钟到几十分钟。 高效液相色谱法除具有以上特点外，它的应用范围也日益扩展。由于它使用了非破坏性检测器，样品被分析后，在大多数情况下，可除去流动相，实现对少量珍贵样品的回收，亦可用于样品的纯化制备。 高效液相色谱法的分类 高效液相色谱法可依据溶质(样品)在固定相和流动相分离过程的物理化学原理分类。 (1)吸附色谱(Adsorption Chromatography) 用固体吸附剂作固定相，以不同极性溶剂作流动相，依据样品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离。 (2)分配色谱(Partition Chromatography) 用载带在固相基体上的固定液作固定相，以不同极性溶剂作流动相，依据样品中各组分在固定液上分配性能的差别来实现分离。根据固定相和液体流动相相对极性的差别，又可分为正相分配色谱和反相分配色谱。当固定相的极性大于流动相的极性时，可称为正相分配色谱或简称正相色谱(Normal Phase Chromatography)；若固定相的极性小于流动相的极性时，可称为反相分配色谱或简称反相色谱(Reversed Phase Chromatography)。 (3)离子色谱(Ion Chromatography) 用高效微粒离子交换剂作固定相，以具有一定pH值的缓冲溶液作流动相，依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上表面带电荷基团进行可逆性离子交换能力的差别而实现分离。 (4)体积排阻色谱(Size Exclusion Chromatography) 用化学惰性的多孔性凝胶作固定相，按固定相对样品中各组分分子体积阻滞作用的差别来实现分离。以水溶液作流动相的体积排阻色谱法，称为凝胶过滤色谱(Gel Filtration Chromatography)；以有机溶剂作流动相的体积排阻色谱法，称为凝胶渗透色谱法(Gel Permeation Chromatography)。 (5)亲和色谱(Affinity Chromatography) 以在不同基体上，键合多种不同特性的配位体作固定相，用具有不同pH值的缓冲溶液作流动相，依据生物分子(氨基酸、肽、蛋白质、核碱、核苷、核苷酸、核酸、酶等)与基体上键联的配位体之间存在的特异性亲和作用能力的差别，而实现对具有生物活性的生物分子的分离。 高效液相色谱法的应用范围和局限性 一、应用范围 高效液相色谱法适于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定易分解的、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性物质和多种天然产物；合成的和天然的高分子化合物等。它们涉及石油化工产品、食品、合成药物、生物化工产品及环境污染物等，约占全部有机化合物的80％。其余20％的有机化合物，包括永久性气体，易挥发低沸点及中等分子量的化合物，只能用气相色谱法进行分析。 二、方法的局限性 第一，在高效液相色谱法中，使用多种溶剂作为流动相，当进行分析时所需成本高于气相色谱法，且易引起环境污染。当进行梯度洗脱操作时，它比气相色谱法的程序升温操作复杂。 第二，高效液相色谱法中缺少如气相色谱法中使用的通用型检测器(如热导检测器和氢火焰离子化检测器)。近年来蒸发激光散射检测器的应用日益增多，有望发展成为高效液相