南农-植物制片报告.docVIP

石蜡制片法观察水生和旱生水花生茎 1、材料 水生水花生旱生水花生石蜡、刀片、白纸板、切片机、烘箱、酒精、二甲苯等实验器材，均由生科院c304实验室提供。 2.1 取材与固定 分别取水生和旱生的水花生，用刀片切成长约为1-1.5cm小段，每一种取约5小段，注意材料不宜过大。材料取下后立即投入固定液中，固定材料的瓶上必须贴标签，标明取材日期，材料名称，小组名称。 固定可保持细胞原有的结构，并使组织硬化，便于切片和染色。本实验采用F.A.A固定液固定材料，F.A.A固定液是植物制片中一种良好的固定液和保存液，材料平常固定2-24小时，但在此液中长期保存也无妨，加入5mL甘油效果更好。 F.A.A固定液配方：福尔马林（38%）5mL 冰醋酸5mL 酒精(70%)90 mL 但需注意：此固定液中含有酒精，易使原生质发生收缩现象，所以细胞学制片和固定单细胞生物、丝状藻类以及菌类，一般采用其它的专用固定剂。如果是幼嫩的叶片则使用50%的酒精进行配制。 2.2脱水与透明 脱水剂渗入植物细胞、组织中，使得细胞组织中原来的水分脱除干净，以便后继药物能更替进入其内。通过脱水，使材料适当硬化，以利于切片。本实验采用浓度逐级升高的酒精作为脱水剂，各级酒精脱水时间一般为2h，酒精要置换两次，但总的放置时间不能太长，以免材料变脆，步骤如下： 30% 50% 70% 85% 95% 100% 100% 材料经脱水后，必须用透明剂取代植物组织中的酒精，以便石蜡渗入其中。本实验采用二甲苯和酒精为透明剂，逐级升高二甲苯的浓度，每级透明时间一般为2h，二甲苯的穿透力较强，不宜在其中放置过久，步骤如下： 1/2酒精+1/2二甲苯 1/4 酒精+3/4二甲苯 纯二甲苯 纯二甲苯 2.3浸蜡包埋 浸蜡过程是用石蜡进一步取代植物细胞组织中的二甲苯，石蜡充分渗入植物组织中的各个部分。待石蜡凝固后，再切片，材料不致压碎破裂。本实验采用熔点为52—54℃的石蜡，在投入之前先用刀片将蜡快修成碎末状，利用其融化，步骤如下： 石蜡放40℃温箱中过夜第二天将温度升至50℃，打开瓶盖倾倒掉一半液体，再加入同量的碎末状石蜡；2h后将温度升至60℃，同时若蜡全融化，则再加如一些蜡；2-3h后换为已融化的纯蜡；2-3h后再换一次纯蜡，再经2-3h后即可包埋。 包埋就是用纯石蜡将整个材料埋藏凝固起来的过程。包埋时，先用质地坚韧光滑不易透水的厚纸张折成小盒，小盒两端要标明材料和小组名称。迅速将材料连同石蜡倒入纸盒中，用加热的解剖针，将材料迅速排好位置（直立，且材料与材料之间有一定的距离），若蜡中有气泡产生，可用烧热的解剖针把气泡烫去。材料安置好后，向蜡面微微吹冷气，使蜡的表面凝结一层，两手执纸盒半浸入水中，待盒中的蜡凝成不透明状时，可平稳的将纸盒全部压入水中充分冷却。半小时后可将包埋好的石蜡快材料取出晾干备用。 2.4切片、贴片和干片 切片使用螺旋式切片机进行。先将蜡快修成上小下大的小块，粘于载蜡器上，将载蜡器安装与切片机上，调整距离和角度，进行切片。本实验切片的厚度为8μm，用小刀将长条蜡带按20-30cm逐段剪取，放于贴片处。 在干净的载玻片上，滴一滴粘贴剂（本实验使用的是蛋清和甘油1：1混匀，再加入微量的草酰乙酸经过滤而成），用干净的手将其均匀涂于载玻片上，再滴加足量的蒸馏水将事先分好的蜡带小段移到载玻片上，使蜡带的光面朝下。之后，将载玻片放在37℃温台上，待蜡受热完全展平后，用吸水纸将多余的水分吸去，放如36-40℃的温箱中继续烘烤1-2天。 2.5 脱蜡和染色 本实验采用番红-固绿整染法。染色的结果是木质化的细胞壁和细胞核被染成红色，薄而具有纤维素的细胞壁及细胞质被染成绿色。染色步骤如下： 将上述所制的片子淹没于番红中，过2天后将片子取出，用蒸馏时冲洗干净，放于温箱中烘3天。再按如下步骤操作： 纯二甲苯（min）纯二甲苯（1min） 1/2酒精 + 1/2 二甲苯（1min） 纯酒精（1min） 纯酒精（20s）固绿（3min） 纯酒精（1min） 纯酒精（1min） 镜检 1/2酒精 + 1/2 二甲苯（2min） 纯二甲苯（3 min） 纯二甲苯（3-5min） 2.5封片、贴标签、干固与保存 将载玻片从二甲苯中取出，用干净的纱布擦去切片材料四周多余的二甲苯，然后上一小滴中性树胶，树胶用量要适当，要正好充满盖玻片下面。 将制好的玻片贴上标签，表明材料、日期和小组名