试验十一质粒DNA的转化.PPT

实验十二 质粒DNA的转化 一、 实验目的 1. 通过本实验学习外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。 2.了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。 二、 相关知识及原理 转化（transformation）： 是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株 克隆的筛选： 主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等 将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。 如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。 虽然只有那些含有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不能确定哪个克隆含有插入片段。 ----鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有?-互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、插入失活、PCR以及杂交筛选的方法。最常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶切分析，对于带有LacZ基因的载体还可以结合?-互补现象来筛选。 2) 菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37℃恒温培养箱内培养过夜(12-16小时)，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养，此时应该能清楚地看到菌落。 四、实验报告 1. 计算转化效率 转化频率＝转化体总数/加入质粒DNA的量（计算出每微克的转化菌落数） 2. 根据实验结果能否判断，长出的菌落既不是杂菌，也不是自发突变。是，请予解释；不是，请设计后续实验验证。 * * 化学方法(热击法):使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞 105-106个转化菌落/ug重组DNA 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。 109个转化菌落/ug重组DNA 转化的方法： 感受态细胞(Competent cells): DH1, DH5, MM294, TOP10 …… 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。 ---- 低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对DNA的吸收 3．操作步骤 感受态细胞：E.coli TOP10 载体：puc18 重组DNA: 浓度 细胞转化 1) 分别取1个100μl感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作) 将样品轻轻摇匀，冰上放置20-30min，于42℃水浴中保温90s，然后迅速冰上冷却2min 质粒DNA十100μl感受态细胞悬液 向样品中加入500-800ulLB培养基，37 ℃低速振荡培养约45-60min---让细菌中质粒表达抗生素抗性蛋白 取各样品培养液0.1ml，分别接种于含抗菌素LB平板培养基上，涂匀（如果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫）。 * * * puc上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。DH5a菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下,pBS和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pBS和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去α-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。