蛋白质组学应用例奶牛乳腺炎课件.pptVIP

健康奶牛与临床型乳腺炎奶牛乳腺核蛋白组差异表达分析 畜牧兽医学报　2010,41(1):105-111 摘　要: （目的）亚细胞蛋白质组的优点在于对低丰度蛋白的研究,运用亚细胞蛋白质组学的研究策略,可以提高低丰度蛋白质在双向电泳中的检出数量。通过分析奶牛乳腺炎乳腺与正常乳腺核蛋白组差异表达情况,为奶牛乳腺炎发病机理研究寻找尽可能多的生物标记分子。 （方法）经超速离心法分离细胞核,双向凝胶电泳分离蛋白,用PDQuest7.4软件分析寻找差异蛋白质斑点,高效液相色谱串联离子阱质谱鉴定蛋白质。 （结果） 从核蛋白组2-DE图谱中筛选出22个差异表达的蛋白质斑点,质谱鉴定出17个差异表达的蛋白质,2个蛋白质在乳腺炎发病过程中下调,7个上调,5个只在正常情况下表达,3个只表达在乳腺炎组织中,筛选出的差异表达蛋白质涉及细胞骨架构成、代谢调节及凋亡调控等许多方面。表明奶牛乳腺炎发生时乳腺组织核结构和代谢状态都发生了的变化。 研究目的: 从奶牛乳腺组织分离细胞核,分析奶牛发生乳腺炎前后乳腺组织核蛋白的变化,寻找更多的新蛋白和新基因,为奶牛乳腺炎的预防和治疗奠定基础。 1.1　样品来源与采集 奶牛来自宁夏回族自治区吴忠市奶牛养殖示 园区,临床型乳腺炎以乳房的外部病变和乳汁理 特性变化为标准筛选健康奶牛和患临床型乳 炎奶牛各10头。奶牛屠宰后,采集乳腺基底组织, 切成1 cm3的小块,生理盐水冲洗干净,分装在5 mL离心管中,液氮保存。 1.2　试剂与设备 17 cm非线性固相化pH梯度胶条为Bio-Rad公司产品;IPG Buffer(pH 3~10)(Amersham公司产品)、Protease Inhibitor、CHAPS、甘氨酸、二硫苏糖醇(DTT)和低熔点琼脂糖为Amresco公司产品;Tris、四甲基乙二胺(TEMED)、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、硫脲、碘乙酰胺、考马斯亮蓝G250、十二烷基硫酸钠、牛血清白蛋白、甲酸、精胺、尿素和甘油为Sigma公司产品;DNase和RNase为Invitrogen公司产;Nycodenz为AXIS-SHIELD公司产品;5′-核苷酸酶试剂盒Genmed公司产品,其余药品均为国产分析纯试剂。 PROTEAN IEF Cell等电聚焦系统和PROTE-ANⅡxi凝胶电泳系统及DQuest7.4图像分析软件系统为Bio-Rad公司产品, BECKMAN L7超速离心机为Beckman公司产品, Milli-Q超纯水系统Millipore公司产品, UMax Scanner 扫描仪系统。 1.3　乳腺组织细胞核的分离 核的分离参考文献[8],取健康奶牛和患乳腺炎奶牛的乳腺组织样品各10个,混合后于冰冷的研钵中研细,1∶4的体积比加入Buffer A(250 mmol·L-1甘露醇,75 mmol·L-1蔗糖,0.1 mmol·L-1EDTA,10mmol·L-1HEPES,0.1 mg·L-1PMSF, pH 7·4)在玻璃匀浆器中反复匀浆3~5次,匀浆液500×g离心20min,小心吸取上清液,1 000×g离心20 min;沉淀用Buffer B(Buffer A加0.5% BSA)溶解,1 000×g离心20 min,重复2~3次。取沉淀物按照1∶1的体积比用Buffer B溶解。预先配制20%和50%Nycodenz溶液,用1 mL注射器从管底向上依次加50% Nycodenz、20% Nycodenz和Buffer B溶解的细胞核悬液于3 mL超速离心管中,体积比约为2∶2∶1,平衡超速离心管准确到1/10 000,封好管口,15 000×g离心60min,用注射器小心吸取50% Nycodenz和20% Ny-codenz之间形成的白色绒毛状悬浮物,平衡在Buffer B中,1 000×g离心20 min,沉淀物就是纯化的奶牛乳腺组织细胞核。收集沉淀物,-70℃保存。 1.4　乳腺组织细胞核纯化效果分析 细胞核纯度检测参考文献[9]:5′-核苷酸酶试剂盒测定纯化前后细胞核匀浆中5′-核苷酸酶活性,计算细胞核的纯化倍数。酶活力以酶蛋白作用底物1 h后的吸光度值来表示,比活力以100μg蛋白产生的酶活力来表示。 　 1.5　核蛋白的提取 取纯化的乳腺细胞核,加30~100μL裂解液Ⅰ(40 mmol·L-1Tris-base, pH 8.4),液氮中反复冻融3~4个循环,加入20μg·mL-1DNase和5μg·mL-1RNase,4℃作用20 min,然后加入蛋白裂解液Ⅱ(