镉对华溪蟹糖与蛋白质分解代谢的影响机制研究.doc

镉对华溪蟹糖和蛋白质分解代谢的影响机制研究 【摘要】：研究目的及意义：山西省在煤炭工业发展、有色金属冶炼和电子工业兴起中普遍存在着镉污染。大量研究表明,当动物受到镉胁迫时,其体内的能量代谢首先会发生变化。本学位论文在课题组前期研究的基础上,综合分析了急性和亚慢性镉处理后,河南华溪蟹(Sinopotamonhenanense)糖和蛋白质分解代谢和能量产生的变化,并从细胞形态学、动物生理学和分子生物学等层面分析了可能的中毒机制,旨在明确溪蟹对镉的代谢反应,筛选敏感分子作为污染指示物,揭示S.henanense对急性和亚慢性镉处理的差异性应激反应,为进一步利用该指示生物鉴定水体的突发性污染和长期污染提供科学依据。研究内容与方法：首先采用亚慢性毒性实验方法,研究了镉对S.henanense血淋巴、肝胰腺和肌肉等组织中糖和蛋白分解代谢基本参数的影响,主要包括与糖分解代谢相关的糖原、葡萄糖、乳酸、乳酸脱氢酶等参数；与蛋白质分解代谢相关的总蛋白、蛋白酶、游离氨基酸、转氨酶、氨、尿素、谷氨酰胺等参数,初步掌握了镉对S.henanense主要能量物质分解代谢的影响。在进一步分析胁迫条件下糖分解代谢的主要途径,即有氧氧化(能量产生的主要方式)和磷酸戊糖途径(还原力产生的主要途径)的变化之前,先分别在急性和亚慢性毒性实验条件下,采用氧电极法对有氧氧化活性的重要衡量指标“氧消耗”进行了测定。在此基础上,针对不同组织的功能特点,采用酶学检测、亚显微技术、基因克隆、实时定量PCR对主要组织糖分解代谢活性进行了评价,主要包括肝胰腺组织磷酸戊糖途径(检测指标为葡萄糖-6磷酸脱氢酶(G-6-PDH)活性和NADPH含量,还原型谷胱甘肽(GSH),氧化型谷胱甘肽(GSSG))含量和GSH/GSSG比值),心脏组织呼吸代谢活性以及肌肉组织呼吸代谢活性(检测指标包括ATP含量、三羧酸循环关键酶NAD-异柠檬酸脱氢酶(NAD-IDH)、呼吸链终端酶细胞色素C氧化酶(CCO)、糖酵解关键酶乳酸脱氢酶(LDH)、CCO活性亚基(cco-1)和ldhmRNA表达水平)。除此之外,为了阐明不同实验条件下氧消耗变化的原因,应用比色法、显微和亚显微技术检测了血淋巴中氧合血蓝蛋白的含量和比例,观察了鳃组织和细胞形态的变化；并采用火焰原子吸收法、镉-血红蛋白饱和法和比色法检测了两种处理对鳃组织中Cd2+蓄积、金属硫蛋白(MT)含量、总超氧化物歧化酶(SOD)活性和膜脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量的影响,旨在揭示急性和亚慢性镉处理导致鳃结构功能发生变化的原因。最后,基于本研究所发现的血糖水平的变化,以及甲壳动物高血糖激素(CHH)对血糖水平的调节作用和镉对CHH潜在的干扰和抑制作用,对CHH合成与分泌的器官“X器-窦腺复合体”的显微和亚显微结构进行了观察,从形态学上初步证明了镉对CHH合成和分泌的影响,为进一步深入研究镉代谢的干扰机制奠定了基础。研究结果：(1)Cd2+暴露7d后,肝糖原和肌糖原含量下降,蛋白质含量降低,伴随着蛋白酶活性的升高,组织中游离氨基酸及谷丙、谷草两种转氨酶活性的增强(P0.05)；血淋巴中的乳酸脱氢酶活性升高,而乳酸的含量并没有发生显著变化(P0.05)。血淋巴中游离氨的含量在该时间段几乎没有发生变化,而血淋巴中检测到的升高的尿素和谷氨酰胺含量则说明了游离氨的去向。Cd2+暴露21d导致了血淋巴中葡萄糖含量的下降；谷丙、谷草两种转氨酶活性在该时间段降低,这将削弱机体对游离氨基酸的利用；同时,血淋巴中游离氨的含量升高,尿素的含量没有显著变化,仅可见谷氨酰胺含量的上升。(2)氧消耗在急性处理组增加,而在亚慢性处理组则相反；氧合血蓝蛋白在血淋巴中的含量和比例经急性和亚慢性镉处理后的变化趋势同氧消耗基本一致；鳃形态学观察结果显示,急性镉处理后鳃叶肥大增厚,部分上皮细胞中出现空泡；亚慢性处理后,鳃叶边缘通道紧缩,上皮细胞高度肿胀,鳃血腔缩小变窄,上皮细胞顶膜微绒毛减少,线粒体嵴溶解消失,细胞核膜断裂变形,核染色质浓缩,边集化；两个处理组中的Cd2+蓄积、MT含量、SOD活性和MDA含量皆高于对照组,其中Cd2+蓄积量和SOD活性在两个处理组之间没有显著差异；急性处理组MT含量显著高于亚慢性组；而亚慢性组MDA含量显著高于急性组。(3)急性镉处理后,G-6-PDH活性显著下降,伴随着NADPH、GSH含量和GSH/GSSG比值的下降；亚慢性镉处理后,在2.86mg/L组,G-6-PDH活性和NADPH含量显著上升,GSH含量先(0.71mg/L)上升后(2.86mg/L)下降,GSSG含量随处理浓度增加显著上升,伴随着GSH/GSSG比值的下降。(4)急性和亚慢性镉处理皆导致溪蟹心脏组织CCO活性的降低和cco-1mRNA表达水平的下调；急性镉处理后,心脏组织ATP含