第三章-基因组文库构建.pptVIP

第三章 基因文库的构建和筛选 来自单个基因组的DNA片段克隆的集合体称为基因文库（gene library或gene bank）。它包括基因组文库（genomic library）和cDNA文库（cDNA library）。 DNA文库是含有某种生物体全部基因的随机片断的重组DNA克隆群体。 cDNA文库是克隆的重组cDNA的总和，通常是建立在细菌或酵母中。这些克隆代表从某个特定物 种或器官的所有mRNA制备得到的cDNA。 无论是建立基因组文库还是cDNA文库，其目的是： ①从复杂的基因组中分离单拷贝的基因； ②是从来源复杂的总mRNA的cDNA文库中分离稀有的cDNA克隆。 第一节 基因文库的构建 一、基因组文库和cDNA文库 基因组文库是含有某种生物体全部基因的随机片断的重组DNA克隆群。其中可能含有基因外显子、内含子、基因5端调控区、3端的尾随序列以及基因间的间隔区。 典型的基因组文库应能“代表”整套的DNA片段，这些序列和原来样本中存在的所有DNA序列相一致，并保持原有的相关丰度。 当需要时，人们能从DNA文库中分离任何特定的基因片段。 ?噬菌体克隆文库的构建。 (a)将外源基因组的DNA片段克隆到?噬菌体载体中来构建基因组文库。菌苔上的噬菌斑中含有大量不同的重组噬菌体，每一个噬菌斑来自单个感染噬菌体的一个克隆。各个克隆带有不同的细胞DNA片段。 (b) 噬菌斑被转移到尼龙膜上，而噬菌体的蛋白被溶解，和重组体DNA分开，DNA吸附到膜上。再将此膜与带有放射性同位素标记的探针进行分子杂交，可以杂交的便是目的基因。 带有此DNA的克隆可通过放射自显影而显现出来。这样阳性克隆可从培养基中分离出来，再转接到新鲜的宿主菌中，使目的因得到扩增。 用?噬菌体置换型载体构建基因文库。 用限制性酶消解?噬菌体载体，切除了中央的片段，再用相同的限制性酶剪切外源基因组DNA，将约15kb的酶切片段随机地和?噬菌体载体的两臂连接，形成线性的重组的串联体。 用体外包装系统将串联体中单个的基因组DNA分别包装入不同噬菌体头部，形成不同的重组噬菌体颗粒。 用重组噬菌体感染适合的宿主菌，产生噬菌斑。每一个噬菌斑来自单个感染噬菌体的一个克隆。 各个克隆带有不同的细胞DNA片段。 一个典型的基因组文库含带有重叠基因片段的多拷贝克隆。 (a)用从原有的克隆DNA片段制备的放射性探针能从典型的基因组文库中分离各种基因片段。用探针1可用来筛选文库，从文库中分离重组DNA片段。用探针2和3来获得与上述片段部分重叠的DNA序列。 罕见的酶切位点和重复DNA序列(如Alu分散元件)可作为界标，用来排列分离的基因组DNA克隆。 (b)从文库中分离的单个的克隆片段含有最小的重叠DNA片段的复合位点。在图中表示已克隆的50kb的基因组DNA中含有三个转录的基因。 克隆数的确定 建库的关键是如何产生足够数量的重组DNA，即基因库要建多大才能保证基因组文库的完整性和代表性。1975 年由L.Clarke 和 J.Carbon 建立了Clarke-Carbon公式，用来估计一个完整的基因文库所需的克隆数，对于构建基因组文库有重要的指导意义。 Clarke-Carbon公式 任一DNA序列在文库中出现的概率： N：该序列需要克隆的总数； P：待克隆DNA序列在文库中设定的出现概 率，一般为99％； I ：待克隆DNA片段的长度，假定为20kb; G : 基因组DNA的总长度，如人类为3×109bp 将数据代入上式 = 7×105 N的含义是克隆大小为20kb的人类DNA时，所构建的基因文库数必须在7×105 个以上克隆时，才能以99％的概率得到此克隆。 二、构建基因文库的克隆载体 和筛选策略 构建基因组文库的第一步是将基因组DNA用限制性酶切成小片段，但酶的选择和酶切反应条件的选择是取决于克隆载体的类型 ?噬菌体克隆文库的构建。 (a)将外源基因组的DNA片段克隆到?噬菌体载体中来构建基因组DNA文库。菌苔上的噬菌斑中含有大量不同的重组噬菌体，每一个噬菌斑来自单个感染噬菌体的一个克隆。 (b) 噬菌斑的模式被转移到尼龙膜上，而噬菌体的蛋白被溶解，和重组体DNA分开，DNA吸附到膜上。再将此膜与带有放射性同位素标记的探针进行分子杂交，可以杂交的便是目的基因。 三、亚克隆 所谓亚克隆（sub-clone）就是