实验四 肝脏DNA提取.ppt

实验四 肝脏DNA的提取 DNA的一般提取步骤： 生物材料的选择 细胞的破碎 机械法 物理法 化学破碎方法 酶学破碎方法 细胞器的分离 在提取细胞线粒体和叶绿体DNA时，必须首先把线粒体和叶绿体与其它细胞器分离出来，一般采取在适当介质中的差速离心法分离。 DNA的提取 去除蛋白质：酚、氯仿 去除多糖、脂类：高盐 抑制DNase活性：去污剂，如SDS、CTAB DNA的沉淀：乙醇或异丙醇 DNA的纯化 有机溶剂抽提 柱层析法 梯度离心法 酶温和消化杂质等 DNA提取的几种方法： 浓盐法 利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。 阴离子去污剂法 由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键相结合，SDS或二甲苯酸钠等阴离子去污剂能使蛋白质发生变性,从而破坏这种价键，因此可以采用阴离子去污剂提取DNA。此法可以直接从生物材料中提取DNA 。 苯酚抽提法 ?苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。 此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。 实验目的： 掌握从动物组织中提取、分离、纯化DNA的基本原理及操作方法。 实验原理： 在细胞核内，核酸通常是与某些组织蛋白质结合成复合物，即以脱氧核糖核蛋白（DNP）和核糖核蛋白（RNP）的形式存在。 在提取时，通常采用0.14 mol/L的盐溶液来除去RNP，使DNP仍保持在沉淀中，然后使用浓盐溶液来提取DNP。 利用去污剂使与DNA结合的蛋白质变性，而与DNA分离，本实验使用的去污剂是SDS； 利用蛋白质不溶于氯仿-异丙醇 ，而DNA却溶解于其中的性质，将蛋白质除去； DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。 实验材料、试剂与器材： 实验材料：新鲜猪肝 试剂 1）溶液A 0.14 mol/L NaCl-0.15 mol/L EDTA-Na2。 2）溶液B 0.015 mol/L NaCl-0.0015 mol/L柠檬酸三钠。 3）溶液C 1.5 mol/L NaCl-0. 15 mol/L柠檬酸三钠。 4）溶液D 3 mol/L乙酸钠-0.001 mol/L EDTA-Na2。 5）5mol/L NaCl。 6）250g/L SDS。 7）氯仿：异丙醇=24：1（V/V）。 8）乙醇（70%、80%、95%、无水）。 2.器材 匀浆器或研钵研杆 移液枪 离心机 天平 恒温水浴箱 玻璃棒 解剖剪及镊子 50ml离心管等 操作步骤： 1.将肝脏置于研钵中，捣碎，并加入5ml的溶液A。制成匀浆后，置于50ml离心管中，5000rpm离心8min。 2.弃上清，加入溶液A 4ml，然后滴加250g/L SDS溶液0.3ml，边加边用玻棒搅拌。 3.加完后，置于60℃水浴保温5min（不停搅拌），取出冷至室温。 4. 加入5mol/L NaCl溶液1.0ml，搅拌5min，加入约一倍体积氯仿：异丙醇=24：1混合液，即5.3ml，振摇5min，离心8min（5000r/min）。小心吸取上清液至一干净的50ml离心管中，记下体积，然后加入1.5倍体积95%乙醇，边加边用玻璃棒缓慢缠绕，DNA丝状物即缠在玻璃棒上。 注意事项： 尽量简化操作步骤，缩短提取过程； 减少化学因素对核酸的降解 ； 减少物理因素对核酸的降解； 防止核酸的生物降解。 思考与作业： 依次说明提取过程中所用的各种试剂在试验中的作用。 本实验中哪些因素不利于DNA分子的完整获得？ * * 指导教师：龚熹 核酸是具有重要生物化学功能的生物大子，最初从细胞核分离出来，又具有酸性，故称为核酸。 脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA) 细胞核 遗传信息的携带者 核糖核酸 (ribonucleic acid, RNA) 细胞质 蛋白质的生物合成，表达调控 从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。 对于低等生物。由于DNA 分子量较小，提取时易保持其结构完整性。 细菌及高等动植物中，DNA 分子量较大，易被机械张力剪断。 学习DNA提取的一般知识； 在不同浓度的盐溶液中，RNP与DNP的溶解度有很大的差别。 溶解度大 (比在水中大2倍) 溶解度小 （仅为水中1%） DNP 溶解度小 溶解度大 RNP 1.0mol/LNaCl 0.14mol/L