细胞分离和胞内产物的溶解_生物分离工程.ppt

第十五章 细 胞 破 碎 五、包涵体的纯化方法 常见的工艺路线(一) 特点:是利用了包含体与细胞碎片的密度差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，获得了干净的包含体，再对包含体溶解复性。 优点：摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使后面的分离纯化简单了。从这个角度上讲，包含体的形成对分离纯化亦有好处。 缺点:要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎片，加工时间较长。 常见的工艺路线（二） 路线（二）应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质。 优点是封闭式操作，不污染环境也不受环境污染，能量消耗也比离心法少。 缺点：细胞碎片和包含体一起被膜挡住，难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常常导致可溶性蛋白质的滞留。 常见的工艺路线（三） 优点是用化学法破碎，所采用的试剂既可以破碎又可以溶解包含体，将两道工序和为一道，节省了设备和时间，比前两者更适合于实验室操作。 缺点是所有的可溶性杂质都没有除去，混杂在产物中间，给后续分离带来困难。 举例：包含体产物分离工艺（牛生长激素） * * * * 一、基本知识 基因工程菌：将目的基因导入细菌体内使其表达，产生所需要的蛋白的细菌成为基因工程菌。 包涵体：在某些生长条件下，基因工程菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。 基因工程包涵体的纯化 包涵体 （ inclusion bodies IBs) 包涵体的组成及特性 一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。 包涵体与蛋白种类及表达系统无关，仅为蛋白过量表达的结果。 二、包涵体的形成原因 在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 最大缺点：一级结构正确，高级结构错误。 1、表达量过高。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对（并非所有），过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。　　2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高（37-42℃）或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。　　4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。 三、包涵体的表达 1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。 3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。 胞外分泌型表达：离心,收集液相→浓缩→纯化。 胞内表达： 胞内可溶性表达：离心,收集菌体→细胞破碎→离心，收集上清→纯化 胞内周质表达：离心,收集菌体→低浓度溶菌酶或渗透压冲击等溶解目标物→离心,收集上清液→纯化。 不溶性包涵体：离心,收集菌体→细胞破碎→离心,收集沉淀→包涵体洗涤→目标蛋白变性溶解→复性→纯化。 四、菌液的前处理 收集菌体细胞 细胞破碎 包涵体的洗涤 目标蛋白的变性溶解 目标蛋白的复性 包含体的出现不仅增加了生物分离设计的难度，也为蛋白质折叠机理研究提出了新的课题。 欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包含体后，溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。 机械破碎 (高压匀浆、高速珠磨） 离心提取包含体 加变性剂溶解 除变性剂复性 六、包涵体的获得 路线1 的特点 机械破碎 膜分离获得包涵体 加变性剂溶解包含体 除变性剂复性 路线2 的特点 化学破碎 （加变性剂） 离心除细胞碎片 除变性剂复性 路线三： 1）包涵体的洗涤 细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。 洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后步纯化带来困难。 洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。 洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包涵体中表达产物为原则。 2）目标蛋白的变性溶解 包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能进一步纯化。一般水溶液很难将其溶解，只有采用蛋白质变性才能使其形成可溶性的