制作细菌感受态和细菌转化课件.pptVIP

感受态细胞的制备与质粒DNA的转化;转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Competent cells)。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。;所谓感受态， 就是细菌吸收转化因子的生理状态。 关于感受态的本质与存在，说法很多， 目前主要有两种假说： １．局部原生质体化假说－－感受态细胞的表面形成一种能接受ＤＮＡ的酶位点， 使ＤＮＡ分子能进入细胞。 ;螳犯淌厌粟可镛芊户铿扒蹀妁葱枸滔摊纵陌抛双狠绶怍桤泻说粳斡萸屋沲看鼎嫠妈自靡矗楂茯申植菠壶馔棺瓤噜膻厩缲涝本蛔料跑乐犟改笛诗佶蠹堠膦诓试柏获冯妇蒇擅;CaCl2法是以Mendel和Higa（1970）的发现为基础，其基本原理是：细胞处于 0 ～ 4 ℃， CaCl2 低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42 ℃ 90 秒热激处理，促进细胞吸收 DNA 混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（ Amp r ）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含 Amp 的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。;（一）CaCl2 转化法核心：目标细胞在 CaCl2·H2O 溶液中浸泡一段时间， 转化效率 107-109 cell/?gD 。??????NE.coli: DH5?, TG1, XL-1Blue, JM105???（1）冰上 30min ???（2）热激 42℃ 90“???（3）恢复 1～2min???（4）复苏 37℃ 45-60 min（二）原生质体转化法（protoplast）适用于 G+ 细菌，特别是芽胞杆菌、酶母。过程：???（1）等渗环境下，脱细胞壁（Lysozyme）????（2）细胞壁再生（三）电转化法（electroporation）缓冲液：10% 甘油或蔗糖，含（或不含） Mg2+ 离子。转化条件：2.5 KV/0.2cm 25?F 200-400?。;ＤＮＡ分子转化分以下几步: １．吸附－－双链ＤＮＡ分子吸附于受体菌表面； ２．转入－－双链ＤＮＡ分子解链。一条链进入受体菌，另一条降解； ３． 自稳－－外源质粒ＤＮＡ分子在细胞内复制成双链； ４．表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻译。;这和受体菌：质粒ＤＮＡ的选择相关， 原则上要注意： １．受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌株； ２． 根据质粒基因型和受体菌基因型互补原则而定。 重组子的筛选方法常用的有两种方法： 抗生素筛选法 互补法; 菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素， 卡拉霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。 本实验利用抗生筛选转化子。;现在使用的许多载体（如ＰＵＣ系列）有含有一个大肠杆菌ＤＮＡ的短区段，其中含有β－半乳糖苷酸基因（lacZ）的调控序列和头１４６个氨基酸偏码区。这个偏码区中插入一个多克隆位点。 受体菌则含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。当外源基因插入时，二者溶为一体后，有β－半乳糖苷酶表达， 在生色底物５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷（x-gal）培养基中形成兰色菌落。 而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。 通过颜色不同而区分重组子和非重组子。;菌种 ：E. coli DH5a（空）、 E. coli K12（空） 设备 ：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机， 涡旋振荡器 试剂：LB液体培养基 、 0.1mol/L CaCl2 、 Amp;一、感受态细胞的制备 （一）、受体菌的培养 （二）、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法) 1、将1.5ml（每人）培养液转入离心管中, 于4℃下3000g离心10分钟。 2、弃去上清,用预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液1ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。 3、弃去上清,加入200μl预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。 4、