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主 要 内 容 定量PCR与常规PCR的区别 荧光定量PCR的原理 常用的热循环仪 定量的方法 重复性和敏感度 应用 如何设计荧光定量PCR的方案 荧光定量PCR与常规PCR的区别 常规PCR技术： 对PCR扩增反应的终产物进行定性及定量分析 荧光定量PCR技术： 对PCR扩增反应中每一个循环的产物 进行定量分析 实时荧光定量PCR的特点 特异性更强 灵敏度高 可直接对产物进行定量 解决PCR污染问题 自动化程度高、操作简单 real time PCR 的扩增曲线 Ct值极具重现性 Ct与初始模板的关系 固定循环数后，荧光信号与模板数成正比 固定荧光信号值后，模板数就与循环数成反比 初始DNA量越多, 荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少 起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量 常用的荧光定量PCR试剂 SYBR Green I Taqman水解探针 分子信标 SYBR Green I 结合到双链DNA的小沟部位 只有和双链DNA结合后才发荧光 SYBR Green I 工作原理 结合解离曲线识别不同的PCR产物 SYBR Green I的特点 可以用于不同的模板 使用方便，价格相对便宜 灵敏度很高 与非特异性产物结合 解离曲线 选择良好的引物和探针并优化反应条件 随着扩增循环数的增加，TaqMan探针释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系 TaqMan探针应用基因检测、病毒定量、细胞因子基因定量、癌细胞基因微突变检测等 其结果都具有高特异性与高敏感性 但只适合于一个特定的目标 分子信标能特异性地检测感兴趣的目标DNA 分子信标可用于单核苷酸多态性的检测 特别适用于检测点突变 只能用于一个特定的目标 设计困难 价格较高 常 用 的 热 循 环 仪 ABI Prism 7700 可以在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增 一次可以测定96个样本，并且速度较快，一批样本的完成只需要2～3小时 用于水解探针、双链DNA结合染料、分子信标的分析 但是它不能实时对扩增结果进行分析，而只能在全部扩增结束后才进行数据分析 定量—— 绝对标准曲线方法 标准品：纯化的质粒dsDNA，体外转录的RNA 准确配制标准系列并且注意其稳定性，最好分装后保存于-80℃ 荧光材料：杂交探针、水解探针或SYBR Green I 不可以使用DNA作为标准品对RNA进行定量 应用于定量病毒荷载量等 定量—— 相对 标准曲线方法 指在测定目的基因的同时测定某一内对照基因，用一系列已知外参物做标准曲线，根据该标准曲线得到目的基因和内对照基因的量，再将目的基因的同内对照基因的比值作为定量的最后结果 标准品：含有目标基因的DNA或RNA 一般选用看家基因校正 常选择看家基因GAPDH 、β-actin、rRNA 在假设样品逆转录效率相同的前提下，可以使用DNA的标准曲线对RNA进行定量 较常用的一种方法 比较Ct法 假设目的基因与看家基因扩增效率相同，数学推导得出 目的基因的量=2-ΔΔCt ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照 2-ΔΔCt表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数 在目的基因与看家基因扩增效率相同的情况下可以直接得到的目的基因相对于管家基因的定量，而不必制作标准曲线 更为简便省时，也是相当可靠的 重 复 性 问 题 判断实验结果优劣的重要指标 主要判断指标为标准差（SD）和变异系数（CV） 影响结果重复性的因素 PCR 反应扩增的效率 优化实验条件，使反应体系达到最佳扩增效率 目的基因的初始浓度 使用初始浓度具有较高数量级的样本或作平行孔 标准曲线的影响 5个稀释度的标准品，涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围 理想的标准品应与样本具有高同源性 ：质粒DNA 或是体外合成、转录的RNA 影 响 敏 感 度 的 因 素 反应体系中形成的引物二聚体的影响 可以用水解探针代替SYBR Green I，有文献报导使用水解探针的敏感性要比SYBR Green I高出10倍。 可以使用热启动办法或使用特殊处理的Taq酶 要尽可能地优化引物设计 如果反应体系中出现PCR的抑制因素，应适当将目的基因的浓度稀释后再进行扩增。 注意避免室温混合各种试剂，并且在一经混合后立即开始进行扩增。 循环数 Mg2＋的浓度 应 用 对各种基因表达进行定量分析 基础研究：不同组织、用药前后、不同发育阶段基因表达 差异的检测 临